Τα κανναβινοειδή αναστέλλουν την γλυκολυτική οδό

Για να εκτιμήσουμε εάν ένας περιορισμός του ενεργητικού μεταβολισμού από τα κανναβινοειδή θα μπορούσε να είναι υπεύθυνος για την ενίσχυση του κυτταρικού επιπέδου AMP, πραγματοποιήσαμε μια στοχευμένη μεταβολική ανάλυση. Προσδιορίσαμε μεταβολές αναδίπλωσης των επιπέδων συγκέντρωσης αρκετών βασικών μεταβολιτών από τη γλυκολιτική οδό κατά την αγωγή με GW ή ACPA.Σχήμα 3αδείχνει μια σημαντική αύξηση της 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (G3P) και του φωσφονοπυρουβικού εστέρα (PEP) και μια μείωση του γαλακτικού (LACT), μετά από θεραπεία 12 ωρών με GW. Αντ ‘αυτού, η θεραπεία ACPA καθόρισε μόνο μια αύξηση G3P (Σχήμα 3β). Για να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι η αύξηση του μεταβολίτη της γλυκόλυσης προσδιορίστηκε με υψηλότερη πρόσληψη γλυκόζης από τα κύτταρα, μετρήσαμε την ποσότητα γλυκόζης στο υπερκείμενο των κατεργασμένων ή μη επεξεργασμένων κυττάρων και διαπιστώσαμε ότι η ενσωμάτωση γλυκόζης δεν άλλαξε σημαντικά κατά τη θεραπεία με κανναβινοειδή (Σχήμα 3γ).

Καθώς το γλυκολυτικό ένζυμο 3-φωσφορική αφυδρογονάση γλυκεραλδεΰδης (GAPDH) είναι γνωστό ότι συμβάλλει στην αναπροσαρμογή της αυτοφαγίας με μετατόπιση στον πυρήνα, ²⁵ αναλύσαμε την κυτταρική κατανομή του GAPDH μετά την αγωγή με GW ή ACPA.Σχήμα 4δείχνει τις εγχώριες εικόνες όπου το GAPDH φαίνεται να μετατοπίζεται στον πυρήνα των κυττάρων μετά από θεραπείες κανναβινοειδών 12 ωρών. Αυτό το αποτέλεσμα παρεμποδίστηκε από NAC ή CC, δείχνοντας την εξάρτησή του από την ενεργοποίηση ROS και AMPK. Αυτά τα δεδομένα υπέδειξαν ότι το αυξημένο επίπεδο G3P που παρατηρήθηκε στη μεταβολική ανάλυση θα μπορούσε να προκύψει από τη μειωμένη παρουσία της GAPDH στο κυτοσόλιο των κυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με κανναβινοειδή.

Το ΡΚΜ2 είναι μια εμβρυϊκή ισομορφή πυροσταφυλικής κινάσης (ΡΚ) που εκφράζεται εκ νέου σε καρκινικά κύτταρα, η οποία αποφωσφορυλιώνει το ΡΕΡ σε πυροσταφυλικό και καθορίζει ένα μεταβολικό πλεονέκτημα για το κύτταρο επιτρέποντας τη διαθεσιμότητα φωσφομεταβολιτών πριν από το πυροσταφυλικό ως πρόδρομος για κυτταρικές συνθέσεις. ²⁶ Για να εκτιμηθεί εάν η δραστικότητα PKM2 μπορεί να είναι υπεύθυνη για αύξηση του επιπέδου PEP κατά GW, αναλύσαμε τη δραστικότητα του PKM2 σε εκχυλίσματα ακατέργαστης πρωτεΐνης από κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με κανναβινοειδή για 12 ή 24 ώρες.Σχήμα 3δδείχνει ότι η δραστικότητα PKM2 μετά τη θεραπεία με GW μειώθηκε σημαντικά στις 12 ώρες και ακόμη περισσότερο στις 24 ώρες, ενώ παρεμποδίστηκε από ACPA μόνο μετά από θεραπεία 24 ωρών. Αυτά τα δεδομένα είναι σύμφωνα με το αυξημένο επίπεδο PEP που παρατηρείται στη μεταβολική ανάλυση μετά από 12 ώρες θεραπείας με GW. Επιπλέον, τα δεδομένα που δεν εμφανίζονται δείχνουν ότι το PEP αυξήθηκε μετά από θεραπεία 24 ωρών με ACPA.

Συνολικά, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν εξασθένηση της γλυκολυτικής οδού από κανναβινοειδή που συσχετίστηκαν με την αύξηση του λόγου ΑΜΡ / ΑΤΡ.

Τα κανναβινοειδή αναστέλλουν τον κύκλο Krebs

Για να εξετάσουμε περαιτέρω τη συμμετοχή του ενεργητικού μεταβολισμού στην επαγωγή της μεσολαβούμενης από AMPK αυτοφαγίας από κανναβινοειδή, αναλύσαμε τους κρίσιμους μεταβολίτες του κύκλου Krebs. Όπως φαίνεται στοΣχήμα 5, μόνο τα επίπεδα του α -κετογλουταρικού (Σχήματα 5α και β) και, σε πολύ μεγάλο βαθμό, αυτές του NADH (Σχήμα 5γ) αυξήθηκε μετά από θεραπείες με κανναβινοειδή. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν την εμφάνιση της αναστολής από την NADH της α -κετογλουταρικής αφυδρογονάσης, του ενζύμου του κύκλου Krebs που είναι πιο ευαίσθητα στα επίπεδα αυτού του συνενζύμου και της βλάβης της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης στην αυξημένη αναλογία ΑΜΡ / ΑΤΡ που προσδιορίζεται από τα κανναβινοειδή. Είναι ενδιαφέρον ότι η NAC μπόρεσε να μειώσει σημαντικά την αύξηση του NADH κατά GW ή ACPA (Σχήμα 5γ, υποδηλώνοντας τη συμμετοχή του οξειδωτικού στρες σε αυτό το αποτέλεσμα. Για να επαληθεύσουμε εάν η εξαρτώμενη από ROS αύξηση NADH συσχετίστηκε με την ενεργοποίηση της οδού φωσφορικής πεντόζης και συνεπώς με τη συσσώρευση του συνενζύμου NADPH, γνωστό ότι έχει βασικό ρόλο στην αντιοξειδωτική απόκριση του κυττάρου, μετρήσαμε τις ποσότητες της φωσφογλυκονολακτόνης και του NADPH. Τα επίπεδα και των δύο ενώσεων παρέμειναν αμετάβλητα μετά την αγωγή με GW ή ACPA, υποδεικνύοντας ότι τα κανναβινοειδή δεν ήταν σε θέση να ενεργοποιήσουν την οδό φωσφορικής πεντόζης στις πειραματικές μας συνθήκες ( Συμπληρωματικό Σχήμα 2 ).

Κυτταρικής καλλιέργειας

PANC1 κυτταρική γραμμή αναπτύχθηκε σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 2 mM γλουταμίνη, 10% FBS, και 50  μ g / ml θειική γενταμυκίνη (BioWhittaker, Lonza, Bergamo, Ιταλία), και επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO ₂ .

Ανάλυση ανοσοκηλίδων

Κύτταρα (1,2 χ ¹⁰⁶ κύτταρα / τριβλίο 10 cm) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως αναφέρθηκε στα σχήματα και μετά λύθηκαν με ρυθμιστικό RIPA για ολικό εκχύλισμα πρωτεΐνης. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με το αντιδραστήριο ανάλυσης πρωτεΐνης Bradford (Pierce, Rockford, IL, USA) χρησιμοποιώντας αλβουμίνη βόειου ορού ως πρότυπο. Σαράντα μg εκχυλισμάτων πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκε μέσω πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου και ηλεκτροτυπώθηκε σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore, Milan, Ιταλία). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με διάλυμα αποκλεισμού (5% γάλα χαμηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά σε 100 mM Tris ρΗ 7,5, 0,9% NaCl, 0,1% Tween 20) και ανιχνεύθηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C με τα πρωτογενή μονοκλωνικά αντισώματα (1 : 1000 σε διάλυμα αποκλεισμού). Ελαφριά αλυσίδα πρωτεΐνη-II (LC-3II), AMPK, phospho-AMPK Thr172, p70S6K, phopsho-p70S6K Thr389, Akt, phospho-Akt Ser473 και PDHK αποκτήθηκαν από Cell Signaling, Euroclone, Milan, Italy, HIF-1 alpha αντίσωμα από την Novus Biologs, το Μιλάνο, την Ιταλία και το α– αντίσωμα τουτουλίνης από Oncogene, Cambridge, MA, USA. Τα δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου IgG (1: 8000 σε διάλυμα αποκλεισμού, Upstate Biotechnology, DBA Italia, Milan, Italy) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση συγκεκριμένων πρωτεϊνών. Η ανοσοανίχνευση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας υποστρώματα χημειοφωταύγειας (Amersham Pharmacia Biotech, Euroclone, Μιλάνο, Ιταλία) και καταγράφηκε χρησιμοποιώντας HyperfilmECL (Amersham Pharmacia Biotech). Οι ζώνες για ολικές και φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες σαρώθηκαν ως ψηφιακές κορυφές και οι περιοχές των κορυφών υπολογίστηκαν σε αυθαίρετες μονάδες χρησιμοποιώντας το δημόσιο τομέα NIH Image software ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ) και στη συνέχεια κανονικοποιήθηκε με α– έκφραση τουμπουλίνης. Οι ποσοτικοποιήσεις ελήφθησαν ως διπλή επαγωγή σε σχέση με τους μάρτυρες και, για φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες, οι ποσοτικοποιήσεις αντιπροσωπεύουν την αναλογία φωσφορυλιωμένης / ολικής πρωτεΐνης.

Εκχύλιση μεταβολίτη

Μεταβολομική αναλύσεις μετά τη θεραπεία για 12 ώρες με 200  μ Μ GW ή ACPA και 20 mM NAC εκτελέστηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως. ⁴¹ κύτταρα παρασκευάστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο από τους Sana et al. , ⁴² με μικρές τροποποιήσεις όπως αναφέρθηκε προηγουμένως. ⁴¹Το δείγμα επαναιωρήθηκε με προσθήκη 0,15 ml παγωμένου εξαιρετικά καθαρού νερού (18 ΜΩ) σε κύτταρα λύσης. Οι σωλήνες βυθίστηκαν σε ξηρό πάγο ή σε λουτρό κυκλοφορίας στους -25 ° C για 0,5 λεπτά και μετά σε υδατόλουτρο στους 37 ° C για 0,5 λεπτά. Σε κάθε σωλήνα προστέθηκαν 0,6 ml −20 ° C μεθανόλης και στη συνέχεια 0,45 ml −20 ° C χλωροφορμίου. Οι σωλήνες αναμιγνύονταν κάθε 5 λεπτά για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, 0,15 ml παγωμένου εξαιρετικά καθαρού νερού ρυθμισμένου με ρΗ προστέθηκαν σε κάθε σωλήνα και αυτά φυγοκεντρήθηκαν στα 1000 × g για 1 λεπτό στους 4 ° C, πριν μεταφερθούν στους -20 ° C για 2-8 ώρες. Μετά την απόψυξη, ανακτήθηκαν υγρές φάσεις και προστέθηκε ισοδύναμος όγκος ακετονιτριλίου για να καθιζάνει οποιαδήποτε υπολειμματική πρωτεΐνη. Οι σωλήνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε ψυγείο (4 ° C) για 20 λεπτά, φυγοκεντρήθηκαν στα 10.000 × gγια 10 λεπτά στους 4 ° C και τα συλλεγέντα υπερκείμενα ξηράνθηκαν για να ληφθούν ορατά σφαιρίδια. Τελικά, τα αποξηραμένα δείγματα επανα-εναιωρήθηκαν σε 1 ml νερού, 5% μυρμηκικού οξέος και μεταφέρθηκαν σε γυάλινα φιαλίδια αυτόματης δειγματοληψίας για ανάλυση LC / MS.

HPLC αντίστροφης φάσης ταχείας ανάλυσης

Χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα Ultimate 3000 Rapid Resolution HPLC (LC Packings, DIONEX, Sunnyvale, CA, USA) για τον διαχωρισμό του μεταβολίτη. Χρησιμοποιήθηκε μια στήλη Dionex Acclaim RSLC 120 C18 2,1 mm × 150 mm × 2,2  μm για το διαχωρισμό των εκχυλισθέντων μεταβολιτών. Χρησιμοποιήθηκε γραμμική διαβάθμιση 0-95% του διαλύτη Α (0,1% μυρμηκικό οξύ σε νερό) έως Β (0,1% μυρμηκικό οξύ σε ακετονιτρίλιο) σε διάστημα 15 λεπτών ακολουθούμενη από συγκράτηση διαλύτη Β 2 λεπτών, επιστρέφοντας σε 100% Α σε 2 διατήρηση διαλύτη A και 6 λεπτά μετά τον χρόνο.

Φασματομετρία μάζας ESI

Οι μεταβολίτες εκλούστηκαν απευθείας σε ιόντα υψηλής χωρητικότητας HCTplus (Bruker-Daltonik, Βρέμη, Γερμανία). Τα φάσματα μάζας για δείγματα που εξήχθησαν από μεταβολίτη αποκτήθηκαν σε λειτουργία θετικού ιόντος. Η τριχοειδής τάση ESI ρυθμίστηκε σε λειτουργία ιόντων 3000 V (+). Ο υγρός νεφελοποιητής ρυθμίστηκε στα 30 psig και το αέριο ξήρανσης αζώτου ρυθμίστηκε σε ρυθμό ροής 9 l / min. Η θερμοκρασία ξηρού αερίου διατηρήθηκε στους 300 ° C. Τα δεδομένα αποθηκεύτηκαν σε λειτουργία κεντροειδούς. Τα εσωτερικά ιόντα αναφοράς χρησιμοποιήθηκαν για να διατηρούν συνεχώς την ακρίβεια της μάζας. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν με ρυθμό 5 φασμάτων / s με αποθηκευμένο εύρος μάζας m / z 50-1500. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό απόκτησης δεδομένων Bruker Esquire Control (v. 5.3 – build 11). Στην ανάλυση MRM, m / zτιμές ενδιαφέροντος απομονώθηκαν, κατακερματισμένες και παρακολουθήθηκαν (είτε τα γονικά είτε τα ιόντα θραύσματος) σε ολόκληρο το εύρος RT. Επικύρωση της HPLC on-line MS-εκλουσμένου μεταβολιτών διεξήχθη με τη σύγκριση των δακτυλικών αποτυπωμάτων μεταβάσεις, όταν εκτελείται η κατάτμηση και να ταιριάζουν εις βάρος των τυποποιημένων μεταβολιτών μέσω της άμεσης έγχυσης με αντλία σύριγγας (ρυθμός έγχυσης 4  μ l / min). Η τυπική βαθμονόμηση καμπύλης πραγματοποιήθηκε είτε σε πρόδρομα είτε σε σήματα ιόντων θραύσματος. Διπλές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν τόσο σε γονικά είδη όσο και σε είδη ιόντων προϊόντος και τα αποτελέσματα υιοθετήθηκαν για ποσοτικό προσδιορισμό. Οι μεταβάσεις παρακολουθήθηκαν για την επικύρωση κάθε ανιχνευμένου μεταβολίτη.

Επεξεργασία δεδομένων μεταβολίτη

Τα αρχεία δεδομένων LC / MS υποβλήθηκαν σε επεξεργασία από το λογισμικό Bruker DataAnalysis 4.0 (build 234), Μιλάνο, Ιταλία. Τα αρχεία από κάθε εκτέλεση είτε αναλύθηκαν ως αρχεία “.d” είτε εξήχθησαν ως αρχεία “.mzXML”, για περαιτέρω επεξεργασία για ευθυγράμμιση φασμάτων, κορυφαία επιλογή και ποσοτικοποίηση με το InSilicos Viewer 1.5.4 (Insilicos LLC; Seattle, WA, USA) .

Πραγματοποιήθηκαν ποσοτικές αναλύσεις πρότυπων ενώσεων σε δεδομένα MRM. Κάθε πρότυπος μεταβολίτης εκτελέστηκε εις τριπλούν, σε στοιχειώδη αραίωση έως ότου επιτευχθούν τα LOD και LOQ. Το όριο ανίχνευσης για κάθε ένωση υπολογίστηκε ως η ελάχιστη ποσότητα που εγχύθηκε που έδωσε μια απόκριση ανιχνευτή υψηλότερη από τρεις φορές την αναλογία σήματος προς θόρυβο (S / N). Η γραμμικότητα των παρατηρούμενων ποσοτήτων, των τιμών κλίσης, αναχαίτισης και γραμμικής συσχέτισης υπολογίστηκε όλα μέσω του Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA).

Ανάλυση πρόσληψης και απελευθέρωσης μεταβολίτη

Τα κύτταρα (1,2 × 10 ⁶ / δίσκος 10 cm) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 12 ώρες με 200  μΜ GW ή ACPA. Το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας συλλέχθηκε και αναλύθηκε με Bioprofile Flex (Nova Biomedical, Waltham, ΜΑ, USA).

Ανάλυση ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα (1,6 × 10 ⁴ ) αναπτύχθηκαν σε καλυπτρίδες και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 12 ώρες με 200  μΜ GW ή ACPA και 20  μΜ CC ή 20 mM NAC. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα GAPDH κουνελιού (1: 100) σε RT για 90 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού Alexa Fluor 488 (1: 500) σε RT για 60 λεπτά. Για να εκτιμηθεί η πυρηνική μορφολογία, τα κύτταρα επωάστηκαν με HOECHST για 2 λεπτά σε RT. Ο φθορισμός οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μήκη κύματος διέγερσης / εκπομπής 488/520 nm (πράσινο) και 350/460 nm (μπλε) για GAPDH και HOECHST, αντίστοιχα. Τα κύτταρα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας TCS-SP5 Leica confocal μικροσκόπιο, Μιλάνο, Ιταλία, σε μεγέθυνση × 40 και × 63.

Δοκιμασία δραστηριότητας PKM2

Ένα μg ολικού εκχυλίσματος πρωτεΐνης που ελήφθη από κύτταρα Panc1 που υποβλήθηκαν σε αγωγή για 12 και 24 ώρες με 200  μΜ GW ή ACPA χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της δραστικότητας PKM2 όπως αναφέρθηκε προηγουμένως. ⁴³

Δοκιμασία δραστηριότητας c-Myc

Τα κύτταρα (4 χ 10 ⁵ κύτταρα / τρυβλίο 6 cm) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 1, 12 ή 24 ώρες με 200  μ Μ GW ή ACPA και έπειτα λύθηκαν με κιτ πυρηνικό εκχύλισμα (Active Motif, Vinci Biochem, Φλωρεντία, Italy) για την πυρηνική και εκχυλίσματα κυτοσολικών πρωτεϊνών. Πέντε μg του πυρηνικού εκχυλίσματος χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση της δραστηριότητας c-Myc μέσω της ανάλυσης ELISA (Active Motif, TransAM, c-Myc).

Πειράματα επιμόλυνσης

Κύτταρα (2,5 χ 10 ⁵ κύτταρα / τρυβλίο 6 cm) επιμολύνθηκαν με τον φορέα έκφρασης pcDNA5 / FRT που περιείχε την ανθρώπινη ΑΜΡΚ γάμμα-2 υπομονάδα wt ή R531G μεταλλαγμένο χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης TransIT-LT1 (Mirus Bologna, Ιταλία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Τα κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες και μετά υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 200  μΜ GW ή ACPA για 12 ώρες, για να αξιολογηθεί ο ρόλος της παραγωγής AMP στην επαγωγή AMPK. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης εκτιμήθηκε με ανάλυση κυτταροφθορομετρίας και ήταν ∼56%. Οι φορείς έκφρασης για την ΑΜΡΚ WT και μεταλλάγματος R531G γ 2 υπομονάδας παρεσχέθησαν ευγενώς από τον Dr. Hawley (Πανεπιστήμιο του Dundee, Σκωτία, Ηνωμένο Βασίλειο).

Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC), Μιλάνο, Ιταλία. Fondazione CariPaRo, Πάδοβα, Ιταλία; Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (PRIN, MIUR), Ρώμη, Ιταλία. Ευχαριστούμε την καθηγητή Michela Giuliano και τον καθηγητή Maurizio Bifulco για την κριτική ανάγνωση του χειρογράφου.