Το Κανναβινοειδές Τετραυδροκανναβινόλη (THC) Προκαλεί Αυτοφαγία σε Καρκινικά του Παγκρέατος

Λογότυπο cddisLink to Publisher's site
. 2013 Ιουν 4 (6): e664.
Δημοσιεύτηκε στο διαδίκτυο 2013 13 Ιουνίου. Doi:  10.1038 / cddis.2013.151
PMCID: PMC3698539
PMID: 23764845

Τα κανναβινοειδή αναστέλλουν τον ενεργητικό μεταβολισμό και προκαλούν αυτοφαγία που εξαρτάται από AMPK σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος

Περιεχόμενα εμφάνιση

(ΑΥΤΟΜΑΤΗ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ GOOGLE)

Περιληψη

Τα αντικαρκινικά αποτελέσματα των κανναβινοειδών έχουν περιγραφεί σε διαφορετικά συστήματα όγκων, συμπεριλαμβανομένου του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος, αλλά ο μηχανισμός δράσης τους παραμένει ασαφής. Χρησιμοποιήσαμε κανναβινοειδή ειδικά για τους υποδοχείς CB1 (ACPA) και CB2 (GW) και μεταβολικές αναλύσεις για να αποκαλύψουμε τις πιθανές οδούς που μεσολαβούν στην εξαρτώμενη από κανναβινοειδή αναστολή της ανάπτυξης κυττάρων καρκίνου του παγκρέατος. Τα κύτταρα Panc1 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με κανναβινοειδή δείχνουν αυξημένη ενεργοποίηση ΑΜΡΚ που προκαλείται από μια εξαρτώμενη από ROS αύξηση της αναλογίας ΑΜΡ / ΑΤΡ. Η ROS προωθεί την πυρηνική μετατόπιση του GAPDH, η οποία ενισχύεται περαιτέρω από την AMPK, μειώνοντας έτσι τη γλυκόλυση. Επιπλέον, το ROS καθορίζει τη συσσώρευση NADH, υποδηλώνοντας την απόφραξη της αναπνευστικής αλυσίδας, η οποία με τη σειρά της αναστέλλει τον κύκλο Krebs. Ταυτόχρονα,Η αναστολή της οδού Akt / c-Myc οδηγεί σε μειωμένη δραστικότητα τόσο της ισομορφής Μ2 πυροσταφυλικής κινάσης (PKM2), περαιτέρω ρύθμιση της γλυκόλυσης και της πρόσληψης γλουταμίνης. Συνολικά, αυτές οι μεταβολές του μεταβολισμού των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος που προκαλούνται από κανναβινοειδή οδηγούν σε ισχυρή πρόκληση αυτοφαγίας και στην αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων.

Λέξεις-κλειδιά: κανναβινοειδή, AMP / ATP, AMPK, μεταβολισμός, αυτοφαγία

Τα κανναβινοειδή είναι μια κατηγορία βιοδραστικών λιπιδίων 1 , 2 , 3 που έχουν μια σειρά από ενδιαφέρουσες δραστηριότητες, συμπεριλαμβανομένης της ικανότητας μείωσης της ανάπτυξης όγκων όπως γλοίωμα, 4 καρκίνος του μαστού, 5 καρκίνος του προστάτη, 6 και καρκίνος του παχέος εντέρου 7 σε διαφορετικά ζωικά μοντέλα . Εμποδίζουν την εξέλιξη του όγκου σε διαφορετικά επίπεδα, με τα πιο διαδεδομένα αποτελέσματα να είναι η αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού με απόπτωση, 8 διακοπή κύκλου κυττάρων, 9 και αυτοφαγία. 10Τα κανναβινοειδή προκαλούν αυτοφαγία σε διάφορους τύπους καρκινικών κυτταρικών σειρών και η φαρμακολογική ή γενετική αναστολή της αυτοφαγίας αποτρέπει την αντιπολλαπλασιαστική δράση τους, αποδεικνύοντας έτσι ότι η αυτοφαγία είναι σημαντική για την αντινεοπλασματική δράση των κανναβινοειδών. 11 Η αυτοφαγία είναι μια εξελικτικά συντηρημένη διαδικασία σε ευκαρυώτες με την οποία κυτταροπλασματικό φορτίο που παγιδεύεται μέσα σε κυστίδια διπλής μεμβράνης παραδίδονται στο λυσόσωμα για αποδόμηση. 12 Αυτή η διαδικασία έχει το ρόλο να απαλλαγούμε από το κύτταρο του ενδοκυτταρικού κακώς-αναδιπλωμένου ή μακρόβιων πρωτεϊνών, περιττή ή κατεστραμμένα οργανίδια, και εισβαλλόντων μικροοργανισμών, και επίσης είναι μια προσαρμοστική απόκριση να παρέχει θρεπτικά συστατικά και την ενέργεια κατά την έκθεση σε διάφορες καταπονήσεις. 13Στα ηπατοκυτταρικά κύτταρα καρκινώματος, τα κανναβινοειδή μπορούν να προκαλέσουν μια εξαρτώμενη από το άγχος ενεργοποίηση της ενεργοποιημένης με AMP πρωτεϊνικής κινάσης (AMPK) που συνεργάζεται με την TRIB3 μεσολαβούμενη αναστολή του άξονα Akt-mTORC1 στη διέγερση του θανάτου των κυττάρων που προκαλούνται από αυτοφαγία. 14 Το AMPK είναι ένας αισθητήρας ενεργειακής κατάστασης που ανταποκρίνεται στην αύξηση της κυτταρικής συγκέντρωσης AMP ή ADP για τη διατήρηση της ομοιόστασης κυτταρικής ενέργειας. 15 AMPK φαίνεται να υπάρχουν παγκοσμίως ως ετεροτριμερικά σύμπλοκα που περιλαμβάνουν καταλυτικές α υπομονάδες και ρυθμιστικές β και γ υπομονάδες. 15 Το αΟι υπομονάδες περιέχουν μια τυπική περιοχή κινάσης σερίνης / θρεονίνης στο Ν άκρο και είναι σημαντικά δραστική μόνο όταν φωσφορυλιώνεται από ανοδικές κινάσες. 15 Οι γ υπομονάδες περιέχουν τέσσερις ρυθμιστικές θέσεις δέσμευσης νουκλεοτιδίων αδενίνης, δύο από τις οποίες δεσμεύουν ανταγωνιστικά AMP, ADP και ATP, και είναι οι θέσεις μέσω των οποίων γίνεται αισθητή η κατάσταση της κυτταρικής ενέργειας. 15 Η κύρια ανάντη φωσφορυλίωση κινάσης Thr 172 της α υπομονάδας, και έτσι ενεργοποίηση της ΑΜΡΚ, στα περισσότερα κύτταρα θηλαστικών είναι η καρκινική κατασταλτική όγκου LKB1. 16 , 17 , 18 Αν και το LKB1 πρέπει να εκφραστεί σε κύτταρα θηλαστικών για παράγοντες που αυξάνουν τις κυτταρικές αναλογίες ΑΜΡ / ΑΤΡ και ΑϋΡ / ΑΤΡ για να προκαλέσουν την ενεργοποίηση της ΑΜΡΚ,16 Αξίζει να τονιστεί ότι αυτά τα αποτελέσματα οφείλονται στη σύνδεση νουκλεοτιδίων αδενίνης με τηνυπομονάδα γ του ΑΜΡΚ και ότι το ίδιο το σύμπλοκο LKB1 φαίνεται να είναι συστατικά ενεργό. 19 Σε ορισμένους τύπους κυττάρων, Thr 172 μπορεί επίσης να φωσφορυλιωθεί από την Ca 2 + / καλμοδουλίνη κινάση πρωτεΐνης που εξαρτάται, CaMKK β , παρέχοντας ένα Ca 2 + -ενεργοποιημένου μονοπατιού για ενεργοποίηση ΑΜΡΚ. 20 , 21 , 22 Η ενεργοποίηση μέσω αυτού του μηχανισμού μπορεί να λάβει χώρα εν απουσία οποιασδήποτε μεταβολής των αδενίνη αναλογίες νουκλεοτιδίων, αν και αυξήσεις στην Ca 2 + μπορεί να δρα συνεργιστικά με αυξήσεις στην AMP ή ADP.23

Πρόσφατα, έχουμε αποδείξει ότι τα κανναβινοειδή και η γεμσιταβίνη, ένα νουκλεοσιδικό ανάλογο που χρησιμοποιείται στη χημειοθεραπεία του καρκίνου, αναστέλλουν συνεργικά την ανάπτυξη των κυττάρων του αδενοκαρκινώματος του παγκρέατος μέσω μιας επαγωγής αυτοφάγου που προκαλείται από ROS. 10

Εδώ, για να ρίξουμε φως στους μοριακούς μηχανισμούς επαγωγής αυτοφαγίας από κανναβινοειδή σε κύτταρα παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος, διερευνήσαμε εάν το AMPK έχει ρόλο σε αυτό το αποτέλεσμα και αν αυτός ο μηχανισμός σχετίζεται με την αλλοίωση του ενεργητικού μεταβολισμού. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήσαμε ανάλυση της αυτοφαγίας με έναν μεταλλάκτη της ισόμορφης γ υπομονάδας 2 της ΑΜΡΚ που δεν μπορεί να δεσμεύσει την ΑΜΡ, τις μεταβολικές αναλύσεις και τον προσδιορισμό της φωσφορυλίωσης, της δραστηριότητας ή του εντοπισμού των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στον ενεργητικό μεταβολισμό ή την αυτοφαγία. Δείχνουμε ότι τα κανναβινοειδή προκαλούν αυτοφαγία που προκαλείται από AMPK σε κύτταρα παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος μέσω μιας εξαρτώμενης από ROS αύξησης του λόγου AMP / ATP.

Αποτελέσματα

Η αυτοφαγία που προκαλείται από κανναβινοειδή εξαρτάται από την ενεργοποίηση του AMPK

Προηγουμένως αποδείξαμε ότι το αραχιδονυλο κυκλοπροπαμίδιο (ACPA) ή το GW405833 (GW), δύο συνθετικοί συνδετήρες κανναβινοειδών ειδικοί για CB1 και CB2, αντιστοίχως, είναι ικανοί να προκαλέσουν αυτοφαγία που προκαλείται από ROS σε κυτταρικές σειρές παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. 10 Για να διερευνήσουμε βαθύτερα τους μοριακούς μηχανισμούς αυτού του αποτελέσματος, πραγματοποιήσαμε σε κύτταρα Panc1 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με κινητικές αναλύσεις ACPA ή GW των φωσφορυλιωμένων AMPK Thr172 (p-AMPK) και του φωσφορυλιωμένου Thr389 p70S6K (p-p70S6K), HIF-1 α και PDHK μεταγενέστερους στόχους του mTORC1, ενός γνωστού αναστολέα της αυτοφαγίας. Όπως φαίνεται στοΦιγούρα 1, μετά από 1 ώρα θεραπείας με κανναβινοειδή, η αύξηση της φωσφορυλίωσης AMPK έχει ήδη συμβεί, με περαιτέρω επέκταση της επίδρασης έως και 24 ώρες (Σχήμα 1α). Αξίζει να σημειωθεί ότι τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης AMPK μειώθηκαν μετά από θεραπεία 12 και 24 ωρών. Ο λόγος φωσφο-p70S6K / p70S6K μειώθηκε μετά από θεραπεία 1 ώρας και σε μεγαλύτερο βαθμό στις 12 και 24 ώρες (Σχήμα 1β, αν και η συνολική πρωτεΐνη που σχηματίστηκε επίσης μειώθηκε μετά από θεραπεία με κανναβινοειδή. Αντ ‘αυτού, HIF-1 α (Σχήμα 1γ) έδειξε μείωση της έκφρασης ξεκινώντας από θεραπεία 12 ωρών και PDHK (Σχήμα 1δ) στις 12 και 24 ώρες για GW και ACPA, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν έντονα ότι το AMPK θα μπορούσε να εμπλέκεται σε επαγωγή αυτοφαγίας από κανναβινοειδή σε παγκρεατικά κύτταρα αδενοκαρκινώματος. Για να εξετάσουμε περαιτέρω τον ρόλο του AMPK σε αυτό το αποτέλεσμα, επεξεργάστηκαν τα κύτταρα με κανναβινοειδή απουσία ή παρουσία της ένωσης C (CC), ενός αναστολέα AMPK, 24 και αναλύσαμε τη φωσφορυλίωση AMPK ως μάρτυρας ( Συμπληρωματικό Σχήμα 1 ) και τη ρύθμιση του ο αυτοφαγικός δείκτης φωσφοαιθανολαμινοποιημένου LC3-II (Σχήμα 2α). Η CC απέτρεψε τη φωσφορυλίωση AMPK και την επαγωγή αυτοφαγίας από κανναβινοειδή, παρέχοντας μια ισχυρή υποστήριξη στην εξάρτηση της αυτοφαγίας που προκαλείται από κανναβινοειδή από την ενεργοποίηση AMPK. Για να αποκλείσουμε τη μη ειδική επίδραση του CC και να χαρακτηρίσουμε τα ανάντη γεγονότα της ενεργοποίησης AMPK από κανναβινοειδή, πραγματοποιήσαμε παροδική επιμόλυνση κυττάρων Panc1 χρησιμοποιώντας ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί τη μεταλλαγμένη ισόμορφη γ υπομονάδα 2 ( γ 2 του AMPK, η οποία δεν μπορεί να δεσμεύσει την AMP ). Τα αποτελέσματα αναφέρονται στοΣχήματα 2β και γδείχνουν ότι η υπερέκφραση της μεταλλαγμένης ΑΜΡΚ ( γ 2 R531G) μειώθηκε σημαντικά τόσο p70S6K αναστολή φωσφορυλίωσης και LC3-ΙΙ επαγωγής από κανναβινοειδών, ενώ άγριου-τύπου ΑΜΡΚ ( γ 2wt) δεν είχε καμία επίδραση σε αυτές τις κανναβινοειδούς δραστηριότητες. Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι το AMPK συμμετείχε σε αυτοφαγία που προκλήθηκε από κανναβινοειδή μέσω ενός μηχανισμού που εξαρτάται από AMP. Για να επιβεβαιώσουμε το ρόλο του AMP σε αυτό το συμβάν και να επαληθεύσουμε εάν θα μπορούσε να εξαρτάται από την παραγωγή ROS, αναλύσαμε τον κυτταρικό λόγο AMP / ATP μετά από θεραπεία με GW ή ACPA απουσία ή παρουσία του ριζικού καθαριστή N- ακετυλο- L- κυστεΐνης ( NAC). Όπως φαίνεται στοΣχήμα 2δ, το επίπεδο των ΑΜΡ / ΑΤΡ αυξήθηκε έντονα από τα κανναβινοειδή, ενώ ήταν παρόμοιο με τον έλεγχο της NAC προ-θεραπείας των κυττάρων.

Ένα εξωτερικό αρχείο που περιέχει μια εικόνα, μια εικόνα κ.λπ. Το όνομα αντικειμένου είναι cddis2013151f1.jpg

Επίδραση των κανναβινοειδών στις βασικές μεταβολικές πρωτεΐνες. Αναλύσεις στυπώματος Western των ( α ) φωσφο-ΑΜΡΚ, ( β ) φωσφο-ρ70S6Κ, ( γ ) HIF-1 άλφα και ( δ ) πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης κινάσης (PDHK) πραγματοποιήθηκαν μετά από αγωγή κυττάρων Panc1 για 1, 12 και 24 h με 200  μ Μ GW ή ACPA. Οι ζώνες σαρώθηκαν ως ψηφιακές κορυφές και οι περιοχές των κορυφών υπολογίστηκαν σε αυθαίρετες μονάδες, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Η τιμή της α- τοτουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως παράγοντας ομαλοποίησης και οι ποσοτικοποιήσεις αντιπροσωπεύουν την αναλογία φωσφορυλιωμένης / ολικής πρωτεΐνης. Οι τιμές ποσοτικοποίησης είναι τα μέσα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (± SD). Στατιστική ανάλυση: * P <0,05, ** P<0,01 και *** P <0,001

Ένα εξωτερικό αρχείο που περιέχει μια εικόνα, εικόνα κ.λπ. Το όνομα αντικειμένου είναι cddis2013151f2.jpg

Ο ρόλος της AMPK στην αυτοφαγία που προκαλείται από κανναβινοειδή. Ανάλυση στυπώματος Western ( α ) LC3-II μετά από θεραπεία κυττάρων Panc1 για 12 ώρες με 200  μ M GW ή ACPA και 20  μ M CC, και ( b ) p-p70S6K και ( c ) LC3-II μετά τη θεραπεία του Panc1 κυττάρων για 12 ώρες με 200  μ Μ GW ή ACPA, υπό την παρουσία ή απουσία των φορέων έκφρασης για την ΑΜΡΚ wT ή μεταλλαγμένης υπομονάδας R531G γάμμα-2. Οι ζώνες σαρώθηκαν ως ψηφιακές κορυφές και οι περιοχές των κορυφών υπολογίστηκαν σε αυθαίρετες μονάδες, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Η τιμή της α- τοτουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως παράγοντας ομαλοποίησης. Οι τιμές είναι τα μέσα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (± SD). ( δ) Αναλογία ΑΜΡ / ΑΤΡ μετρήθηκε μετά από 12 ώρες θεραπείας με 200  μ Μ GW ή ACPA, εν τη απουσία ή παρουσία ενός προ-θεραπεία επί 1 ώρα με 20 mM NAC, όπως αναφέρεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι τιμές είναι τα μέσα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (± SD). Στατιστική ανάλυση: * P <0,05, ** P <0,01 και *** P <0,001

Τα κανναβινοειδή αναστέλλουν την γλυκολυτική οδό

Για να εκτιμήσουμε εάν ένας περιορισμός του ενεργητικού μεταβολισμού από τα κανναβινοειδή θα μπορούσε να είναι υπεύθυνος για την ενίσχυση του κυτταρικού επιπέδου AMP, πραγματοποιήσαμε μια στοχευμένη μεταβολική ανάλυση. Προσδιορίσαμε μεταβολές αναδίπλωσης των επιπέδων συγκέντρωσης αρκετών βασικών μεταβολιτών από τη γλυκολιτική οδό κατά την αγωγή με GW ή ACPA.Σχήμα 3αδείχνει μια σημαντική αύξηση της 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (G3P) και του φωσφονοπυρουβικού εστέρα (PEP) και μια μείωση του γαλακτικού (LACT), μετά από θεραπεία 12 ωρών με GW. Αντ ‘αυτού, η θεραπεία ACPA καθόρισε μόνο μια αύξηση G3P (Σχήμα 3β). Για να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι η αύξηση του μεταβολίτη της γλυκόλυσης προσδιορίστηκε με υψηλότερη πρόσληψη γλυκόζης από τα κύτταρα, μετρήσαμε την ποσότητα γλυκόζης στο υπερκείμενο των κατεργασμένων ή μη επεξεργασμένων κυττάρων και διαπιστώσαμε ότι η ενσωμάτωση γλυκόζης δεν άλλαξε σημαντικά κατά τη θεραπεία με κανναβινοειδή (Σχήμα 3γ).

Ένα εξωτερικό αρχείο που περιέχει εικόνα, εικόνα κ.λπ. Το όνομα αντικειμένου είναι cddis2013151f3.jpg

Επίδραση των κανναβινοειδών στη γλυκόλυση. Το Panc1 υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 12 ώρες με ( a ) GW ή ( b ) ACPA και η ανάλυση μεταβολιτών πραγματοποιήθηκε όπως αναφέρεται στα Υλικά και Μέθοδοι. FDP, 1,6-διφωσφορική φρουκτόζη. F6P, 6-φωσφορική φρουκτόζη; G3P, 3-φωσφορική γλυκεραλδεϋδη. G6P, 6-φωσφορική γλυκόζη; LACT, γαλακτικό; PEP, φωσφονοπυρουβικό εστέρα. ( γ ) Η κατανάλωση γλυκόζης μετρήθηκε όπως αναφέρεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Οι τιμές είναι τα μέσα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (± SD). ( δ ) Η δραστηριότητα PKM2 πραγματοποιήθηκε μετά από θεραπεία κυττάρων Panc1 για 12 ή 24 ώρες με 200  μΜ GW ή ACPA, όπως αναφέρεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Οι τιμές είναι τα μέσα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (± SD). Στατιστική ανάλυση: * P<0,05, ** P <0,01 και *** P <0,001

Καθώς το γλυκολυτικό ένζυμο 3-φωσφορική αφυδρογονάση γλυκεραλδεΰδης (GAPDH) είναι γνωστό ότι συμβάλλει στην αναπροσαρμογή της αυτοφαγίας με μετατόπιση στον πυρήνα, 25 αναλύσαμε την κυτταρική κατανομή του GAPDH μετά την αγωγή με GW ή ACPA.Σχήμα 4δείχνει τις εγχώριες εικόνες όπου το GAPDH φαίνεται να μετατοπίζεται στον πυρήνα των κυττάρων μετά από θεραπείες κανναβινοειδών 12 ωρών. Αυτό το αποτέλεσμα παρεμποδίστηκε από NAC ή CC, δείχνοντας την εξάρτησή του από την ενεργοποίηση ROS και AMPK. Αυτά τα δεδομένα υπέδειξαν ότι το αυξημένο επίπεδο G3P που παρατηρήθηκε στη μεταβολική ανάλυση θα μπορούσε να προκύψει από τη μειωμένη παρουσία της GAPDH στο κυτοσόλιο των κυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με κανναβινοειδή.

Ένα εξωτερικό αρχείο που περιέχει εικόνα, εικόνα κ.λπ. Το όνομα αντικειμένου είναι cddis2013151f4.jpg

Τα κανναβινοειδή προκαλούν πυρηνική μετατόπιση GAPDH που εξαρτάται από AMPK. Αντιπροσωπευτικά ομοεστιακό εικόνες του GAPDH μετατόπιση σε πυρήνες κυττάρων PANC1 μετά την αγωγή 12 ώρες με 200  μ Μ GW ή ACPA εν τη απουσία ή παρουσία ενός προ-θεραπεία επί 1 ώρα με 20 mM NAC ή 20  μ Μ CC Οι τιμές είναι οι μέσες τριών ανεξάρτητων πειράματα (± SD)

Το ΡΚΜ2 είναι μια εμβρυϊκή ισομορφή πυροσταφυλικής κινάσης (ΡΚ) που εκφράζεται εκ νέου σε καρκινικά κύτταρα, η οποία αποφωσφορυλιώνει το ΡΕΡ σε πυροσταφυλικό και καθορίζει ένα μεταβολικό πλεονέκτημα για το κύτταρο επιτρέποντας τη διαθεσιμότητα φωσφομεταβολιτών πριν από το πυροσταφυλικό ως πρόδρομος για κυτταρικές συνθέσεις. 26 Για να εκτιμηθεί εάν η δραστικότητα PKM2 μπορεί να είναι υπεύθυνη για αύξηση του επιπέδου PEP κατά GW, αναλύσαμε τη δραστικότητα του PKM2 σε εκχυλίσματα ακατέργαστης πρωτεΐνης από κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με κανναβινοειδή για 12 ή 24 ώρες.Σχήμα 3δδείχνει ότι η δραστικότητα PKM2 μετά τη θεραπεία με GW μειώθηκε σημαντικά στις 12 ώρες και ακόμη περισσότερο στις 24 ώρες, ενώ παρεμποδίστηκε από ACPA μόνο μετά από θεραπεία 24 ωρών. Αυτά τα δεδομένα είναι σύμφωνα με το αυξημένο επίπεδο PEP που παρατηρείται στη μεταβολική ανάλυση μετά από 12 ώρες θεραπείας με GW. Επιπλέον, τα δεδομένα που δεν εμφανίζονται δείχνουν ότι το PEP αυξήθηκε μετά από θεραπεία 24 ωρών με ACPA.

Συνολικά, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν εξασθένηση της γλυκολυτικής οδού από κανναβινοειδή που συσχετίστηκαν με την αύξηση του λόγου ΑΜΡ / ΑΤΡ.

Τα κανναβινοειδή αναστέλλουν τον κύκλο Krebs

Για να εξετάσουμε περαιτέρω τη συμμετοχή του ενεργητικού μεταβολισμού στην επαγωγή της μεσολαβούμενης από AMPK αυτοφαγίας από κανναβινοειδή, αναλύσαμε τους κρίσιμους μεταβολίτες του κύκλου Krebs. Όπως φαίνεται στοΣχήμα 5, μόνο τα επίπεδα του α -κετογλουταρικού (Σχήματα 5α και β) και, σε πολύ μεγάλο βαθμό, αυτές του NADH (Σχήμα 5γ) αυξήθηκε μετά από θεραπείες με κανναβινοειδή. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν την εμφάνιση της αναστολής από την NADH της α -κετογλουταρικής αφυδρογονάσης, του ενζύμου του κύκλου Krebs που είναι πιο ευαίσθητα στα επίπεδα αυτού του συνενζύμου και της βλάβης της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης στην αυξημένη αναλογία ΑΜΡ / ΑΤΡ που προσδιορίζεται από τα κανναβινοειδή. Είναι ενδιαφέρον ότι η NAC μπόρεσε να μειώσει σημαντικά την αύξηση του NADH κατά GW ή ACPA (Σχήμα 5γ, υποδηλώνοντας τη συμμετοχή του οξειδωτικού στρες σε αυτό το αποτέλεσμα. Για να επαληθεύσουμε εάν η εξαρτώμενη από ROS αύξηση NADH συσχετίστηκε με την ενεργοποίηση της οδού φωσφορικής πεντόζης και συνεπώς με τη συσσώρευση του συνενζύμου NADPH, γνωστό ότι έχει βασικό ρόλο στην αντιοξειδωτική απόκριση του κυττάρου, μετρήσαμε τις ποσότητες της φωσφογλυκονολακτόνης και του NADPH. Τα επίπεδα και των δύο ενώσεων παρέμειναν αμετάβλητα μετά την αγωγή με GW ή ACPA, υποδεικνύοντας ότι τα κανναβινοειδή δεν ήταν σε θέση να ενεργοποιήσουν την οδό φωσφορικής πεντόζης στις πειραματικές μας συνθήκες ( Συμπληρωματικό Σχήμα 2 ).

Ένα εξωτερικό αρχείο που περιέχει εικόνα, εικόνα κ.λπ. Το όνομα αντικειμένου είναι cddis2013151f5.jpg

Επίδραση κανναβινοειδών στον κύκλο Krebs. Το Panc1 υποβλήθηκε σε αγωγή για 12 ώρες με 200  μΜ ( α ) GW ή ( β ) ACPA και η ανάλυση των μεταβολιτών πραγματοποιήθηκε όπως αναφέρεται στα Υλικά και Μέθοδοι. ΚΕΤ, άλφα-κετογλουταρικό · MA, malate; SUCC, ηλεκτρικό. ( Γ ) NADH μετρήθηκε μετά από 12 ώρες θεραπείας με 200  μ Μ GW ή ACPA παρουσία ή απουσία ενός προεπεξεργασίας για 1 ώρα με 20 mM NAC, όπως αναφέρεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι τιμές είναι τα μέσα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (± SD). Στατιστική ανάλυση: * P <0,05, ** P <0,01 και *** P <0,001

Τα κανναβινοειδή αναστέλλουν την αναπληρωτική ροή του κύκλου Krebs από τη γλουταμίνη

Η γλουταμίνη και η γλυκόζη είναι τα μόνα δύο μόρια που καταβολίζονται σε αξιόλογες ποσότητες στα περισσότερα κύτταρα θηλαστικών στην καλλιέργεια, για να τροφοδοτήσουν το κύτταρο με το μεγαλύτερο μέρος του άνθρακα, του αζώτου, της ελεύθερης ενέργειας και των αναγωγικών ισοδυνάμων. Για να εκτιμήσουμε εάν η ρύθμιση του καταβολισμού της γλουταμίνης συμμετείχε στην υποβάθμιση του ενεργειακού μεταβολισμού, μετρήσαμε τα επίπεδα της γλουταμίνης και του γλουταμινικού στο μέσο καλλιέργειας μετά τη θεραπεία κυττάρων με κανναβινοειδή.Σχήμα 6αδείχνει ότι η ενσωμάτωση της γλουταμίνης μειώθηκε έντονα τόσο από το GW όσο και από το ACPA, ενώ η απελευθέρωση γλουταμινικού παρέμεινε αμετάβλητη. Το ογκογόνο c-Myc έχει περιγραφεί ότι συντονίζει την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στον καταβολισμό της γλουταμίνης, συμπεριλαμβανομένης της επαγωγής μεταφορέων γλουταμίνης. 27 Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι το Akt προκαλεί την υπερβολική ρύθμιση του c-Myc και ότι η καταστολή Akt αναστέλλει την έκφραση c-Myc. 28 Αξιολογήσαμε και τη φωσφορυλίωση Akt στη σερίνη 473, η οποία αποτελεί δείκτη ενεργοποίησης αυτής της κινάσης, και τη δραστηριότητα c-Myc μετά από θεραπείες GW ή ACPA.Σχήματα 6β και γδείχνουν ότι η GW ανέστειλε έντονα τη φωσφορυλίωση Akt και τη δραστηριότητα c-Myc σε θεραπεία 12 ωρών και ακόμη περισσότερο στις 24 ώρες, ενώ το ACPA καθόρισε μια σημαντική μείωση και των δύο πρωτεϊνών μόνο σε θεραπεία 24 ωρών. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αναστολή της πρόσληψης γλουταμίνης από κανναβινοειδή θα μπορούσε να εξαρτάται, τουλάχιστον για την GW, από την καταστολή των μεταφορέων γλουταμίνης που καθορίζεται από τη μείωση της δραστικότητας του c-Myc.

Ένα εξωτερικό αρχείο που περιέχει εικόνα, εικόνα κ.λπ. Το όνομα αντικειμένου είναι cddis2013151f6.jpg

Επίδραση των κανναβινοειδών στο μεταβολισμό της γλουταμίνης. ( Α ) Οι αναλύσεις πρόσληψης γλουταμίνης και την απελευθέρωση γλουταμικού διεξήχθησαν μετά την επεξεργασία των κυττάρων PANC1 για 12 ώρες με 200  μ Μ GW ή ACPA. ( β ) Η ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα κυττάρων Panc1 που υποβλήθηκαν σε αγωγή για 1, 12 και 24 ώρες με 200  μΜ GW ή ACPA. Οι ζώνες σαρώθηκαν ως ψηφιακές κορυφές και οι περιοχές των κορυφών υπολογίστηκαν σε αυθαίρετες μονάδες, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Η τιμή της α- τοτουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως παράγοντας ομαλοποίησης και οι ποσοτικοποιήσεις αντιπροσωπεύουν την αναλογία φωσφορυλιωμένης / ολικής πρωτεΐνης. Οι τιμές είναι τα μέσα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (± SD). ( γΔραστηριότητα) c-myc αναλύθηκε μετά τη θεραπεία για 1, 12 και 24 ώρες με 200  μ Μ GW ή ACPA. Οι τιμές είναι τα μέσα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (± SD). Στατιστική ανάλυση: * P <0,05, ** P <0,01 και *** P <0,001

Συζήτηση

Η AMPK έχει αποδειχθεί ότι έχει καθοριστικό ρόλο στην αυτοφαγία που προκαλείται από κανναβινοειδή. 14 Αναφέρουμε προηγουμένως 10 ότι τα κανναβινοειδή αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος τόσο in vitro όσο και in vivo , και η αυτοφαγία έχει αποδειχθεί ότι μεσολαβεί σε αυτή τη διαδικασία 10 , 11 ή ότι είναι ο ίδιος ένας μηχανισμός θανάτου. 10Καθώς τα αντικαρκινικά αποτελέσματα των κανναβινοειδών αρχίζουν να αξιολογούνται κλινικά, ακολουθώντας τα πολλά υποσχόμενα προκλινικά δεδομένα, η ανάγκη σαφούς καθορισμού των μοριακών μηχανισμών της αυτοφαγίας που προκαλείται από κανναβινοειδή έχει γίνει πιο κρίσιμη. Σε αυτήν τη μελέτη, αποδείξαμε για πρώτη φορά ότι δύο συνθετικά κανναβινοειδή, ACPA και GW, ενεργοποίησαν το AMPK και την αυτοφαγία στα κύτταρα του αδενοκαρκινώματος του παγκρέατος αυξάνοντας την αναλογία κυτταρικού AMP / ATP.

Είναι ευρέως γνωστό ότι το AMPK ασκεί ενεργό ρόλο στην αυτοφαγία αναστέλλοντας το mTORC1, τον κύριο ρυθμιστή της πρωτεϊνικής σύνθεσης και την ανάπτυξη των κυττάρων. 29 Στη μελέτη μας βρήκαμε ότι το επίπεδο φωσφορυλίωση της p70S6K, με άμεσο στόχο mTORC1, μειώθηκε σημαντικά μετά από θεραπεία κανναβινοειδών και ότι η εκδήλωση αυτή ξεκίνησε σε πολύ πρώιμο στάδιο, και συσχετίζεται με την αύξηση της φωσφορυλίωσης ΑΜΡΚ. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η μείωση του HIF-1 α, ένας παράγοντας μεταγραφής που ρυθμίζεται έμμεσα από το mTORC1 μέσω σταθεροποίησης πρωτεϊνών, ξεκίνησε μόνο μετά από 12 ώρες θεραπείας και, με τη σειρά του, η μείωση ενός από τους στόχους του, του PDHK, κυρίως μετά από 24 ώρες και με τα δύο κανναβινοειδή. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υπέδειξαν έντονα ότι ο κύριος ιστότοπος της αυτοφαγικής ρύθμισης από το ενεργοποιημένο με κανναβινοειδές AMPK ήταν το mTORC1.

Η ενεργοποίηση ΑΜΡΚ γενικά προκαλείται από την αύξηση των κυτταρικών αναλογιών ΑΜΡ / ΑΤΡ και ΑϋΡ / ΑΤΡ που ευνοεί τη σύνδεση νουκλεοτιδίων αδενίνης με την γ υπομονάδα της ΑΜΡΚ. 15 Στους περισσότερους τύπους κυττάρων, αυτό το συμβάν ακολουθείται από τη φωσφορυλίωση Thr 172 από το σύμπλοκο LKB1, το οποίο φαίνεται να είναι συστατικά ενεργό. 15 Η πρωτεΐνη κινάση που εξαρτάται από Ca2 + / καλμοδουλίνη (CaMKK β ) έχει επίσης αναφερθεί ότι φωσφορυλιώνει την ΑΜΡΚ στην ίδια θέση σε ορισμένους τύπους κυττάρων. 15 Ωστόσο, η ενεργοποίηση μέσω αυτού του μηχανισμού μπορεί να λάβει χώρα εν απουσία οποιασδήποτε αλλαγής στην αδενίνη νουκλεοτιδίου αναλογίες, αν και αυξήσεις στην Ca 2+ μπορεί να δράσει συνεργιστικά με αυξήσεις στην AMP ή ADP. 23Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι σε κύτταρα που υπερεκφράζουν ένα ΑΜΡΚ που περιέχει μια μετάλλαξη στην ισόμορφη γ υπομονάδα 2 που καθιστά το ένζυμο μη ευαίσθητο στις αυξήσεις της ΑΜΡ ή της ΑϋΡ, η οδός αυτοφαγίας δεν ενεργοποιήθηκε μετά από θεραπεία με κανναβινοειδή. Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι στο πειραματικό μας σύστημα ο κύριος μηχανισμός ενεργοποίησης ΑΜΡΚ από κανναβινοειδή εξαρτάται από την αλλαγή των αναλογιών νουκλεοτιδίων αδενίνης και υποδηλώνει ότι το LKB1 θα μπορούσε να εμπλέκεται στην επακόλουθη φωσφορυλίωση του ΑΜΡΚ στο Thr 172.

Το AMPK έχει περιγραφεί ως αισθητήρας και ρυθμιστής ενδοκυτταρικής ενέργειας 30, αλλά είναι επίσης σημαντικό στη διατήρηση της ενδοκυτταρικής ομοιόστασης κατά τη διάρκεια πολλών ειδών προκλήσεων στρες, όπως το οξειδωτικό στρες, το οποίο έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί AMPK. 31 Σε προηγούμενες χαρτί μας, αποδείξαμε ότι τα κανναβινοειδή ACPA και GW ήταν σε θέση να προκαλέσει οξειδωτικό στρες στο αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος κυτταρικές σειρές, οι οποίες ήταν ζωτικής σημασίας για την πυροδότηση αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη. 10 Εδώ, αναφέραμε ότι το ROS ήταν απαραίτητο για την αύξηση της αναλογίας AMP / ATP, η οποία με τη σειρά της μεσολάβησε την ενεργοποίηση του AMPK από κανναβινοειδή που οδηγούν σε αυτοφαγία. Σε συμφωνία με το αποτέλεσμα μας, οι Shrivastava et al. 32πρόσφατα έδειξαν ότι η κανναβιδιόλη προκαλεί απόπτωση και αυτοφαγία αυξάνοντας την παραγωγή ROS. 32 Βρήκαμε ότι το κυτταρικό επίπεδο NADH αυξήθηκε έντονα μετά από θεραπεία κυττάρων με ACPA ή GW και ότι αυτή η αύξηση παρεμποδίστηκε παρουσία του NAC ριζικού καθαριστή. Επιπλέον, το προηγούμενο έγγραφο 10και μη δημοσιευμένα αποτελέσματα έδειξαν ότι η παραγωγή ROS συνέβη μόλις 30 λεπτά μετά την έναρξη της θεραπείας με κανναβινοειδή. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η παραγωγή ROS από κανναβινοειδή θα μπορούσε να επηρεάσει την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων που οδηγεί σε συσσώρευση NADH και σε οξειδωτική αναστολή φωσφορυλίωσης, η οποία με τη σειρά της θα μπορούσε να αυξήσει περαιτέρω το επίπεδο του ROS. Σύμφωνα με αυτήν την υπόθεση, έχουν δημοσιευτεί πολλά άρθρα που περιγράφουν το οξειδωτικό στρες ως αιτία του μιτοχονδριακού τραυματισμού, που συμβαίνει συχνά στο επίπεδο του συμπλόκου Ι της αναπνευστικής αλυσίδας με άμεση οξείδωση των πρωτεϊνών που ανήκουν στο σύμπλεγμα. 33Σε συσχέτιση με την ισχυρή αύξηση του επιπέδου NADH μετά από θεραπεία με κανναβινοειδή, βρήκαμε μια ισχυρή αύξηση του λόγου ΑΜΡ / ΑΤΡ, που υποδηλώνει ότι η αναστολή της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης θα μπορούσε να διαδραματίσει καθοριστικό ρόλο στη δημιουργία της ενεργητικής διακοπής του κυττάρου. Περαιτέρω μελέτες έχουν προγραμματιστεί για να αποσαφηνιστεί αυτή η πτυχή.

Οι αναλύσεις μας για βασικούς μεταβολίτες και ένζυμα της γλυκόλυσης πρότειναν μια γενική αναστολή της οδού μετά από θεραπεία με ACPA ή GW. Παρόλο που η πρόσληψη γλυκόζης από τα κύτταρα παρέμεινε αμετάβλητη, το επίπεδο δύο γλυκολυτικών μεταβολιτών, G3P και PEP, αυξήθηκε σημαντικά σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με κανναβινοειδή, συσχετίζοντας καλά με τη μείωση των αντίστοιχων ενζύμων, GAPDH και PKM2.

Το GAPDH έχει αναφερθεί πρόσφατα ως βασική πρωτεΐνη που είναι ευαίσθητη στην οξειδοαναγωγή, η δραστηριότητα της οποίας επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από ομοιοπολικές οξειδωτικές τροποποιήσεις στο εξαιρετικά αντιδραστικό Cys152. 34 Αυτές οι τροποποιήσεις διεγείρουν την πυρηνική μετατόπιση του ενζύμου και ρυθμίζουν την τύχη του κυττάρου, 35 που συχνά οδηγεί σε ενεργοποίηση της αυτοφαγίας ρυθμίζοντας την αυτοφαγική πρωτεΐνη Atg12. 34 Επιπλέον, το AMPK έχει αποδειχθεί ότι διεγείρει τη μετατόπιση του GAPDH στους πυρήνες. 36 Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι τόσο η NAC όσο και η CC ανέστειλαν την πυρηνική μετατόπιση GAPDH, αποδεικνύοντας ότι αυτό το συμβάν μεσολαβούσε τόσο από την ROS όσο και από την AMPK.

Το PKM2 είναι η ισόμορφη εμβρυϊκή πυροσταφυλική κινάση, σχεδόν καθολικά, εκφρασμένη εκ νέου σε καρκίνο που προάγει την αερόβια γλυκόλυση. 37 , 38 Έχει αποδειχθεί πρόσφατα ότι το c-Myc ρυθμίζει την μεταγραφή γονιδίων που εμπλέκονται στην εναλλακτική σύνδεση που οδηγεί στην έκφραση του PKM2. 37 , 39 Τα αποτελέσματά μας έδειξαν μια αυστηρή συσχέτιση μεταξύ των δραστηριοτήτων PKM2 και c-Myc τόσο σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ACPA όσο και σε GW, υποδηλώνοντας ότι τα κανναβινοειδή καθόρισαν την κάτω ρύθμιση του PKM2 μέσω της αναστολής του c-Myc.

Το c-Myc είναι ένα κλασικό ογκογόνο που προάγει όχι μόνο τον πολλαπλασιασμό αλλά και την παραγωγή συνοδευτικών μακρομορίων και αντιοξειδωτικών που απαιτούνται για την ανάπτυξη. 37 c-Myc αυξάνει την πρόσληψη γλουταμίνης προκαλώντας άμεσα την έκφραση των μεταφορέων γλουταμίνης 27 και προάγει την έκφραση της ισομορφής ΡΚΜ2. 39 Επιπλέον, το c-Myc ρυθμίζεται από τον Akt, η καταστολή του οποίου αναστέλλει την έκφραση του c-Myc. 28Οι κινητικές αναλύσεις μας έδειξαν ότι το GW ανέστειλε τη φωσφορυλίωση Akt στις 12 ώρες και ακόμη περισσότερο στις 24 ώρες, ενώ το ACPA ανέστειλε τη φωσφορυλίωση Akt στις 24 ώρες θεραπείας. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν κατά την ανάλυση της δραστηριότητας c-Myc. Αυτά τα ευρήματα πρότειναν την εξάρτηση της μείωσης του c-Myc από την αναστολή της φωσφορυλίωσης Akt από τα κανναβινοειδή. Ένας από τους κύριους ρυθμιστές του Akt είναι η φωσφατάση PTEN, ένας καταστολέας όγκου που μεταλλάχθηκε σε ένα ευρύ φάσμα καρκίνων του ανθρώπου, η δραστηριότητα του οποίου έχει βρεθεί ότι αυξάνεται κατά τη θεραπεία με ενδοκανναβινοειδή. 40

Συνοπτικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν για πρώτη φορά ότι η εξαρτώμενη από κανναβινοειδή επαγωγή αυτοφαγίας σε κύτταρα παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος σχετίζεται αυστηρά με την αναστολή του ενεργητικού μεταβολισμού, ο οποίος, με τη σειρά του, εξαρτάται από την πρώιμη παραγωγή ROS που προκαλείται από τις ενώσεις. ΣεΣχήμα 7, προτείνουμε ένα μοντέλο του μηχανισμού επαγωγής αυτοφαγίας από τα κανναβινοειδή ACPA και GW σε κύτταρα παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος που βασίζεται στα αποτελέσματα που παρουσιάζονται σε αυτό το έγγραφο και σε δεδομένα βιβλιογραφίας.

Ένα εξωτερικό αρχείο που περιέχει εικόνα, εικόνα κ.λπ. Το όνομα αντικειμένου είναι cddis2013151f7.jpg

Σχηματική αναπαράσταση του μοντέλου που περιγράφει την αναστολή του ενεργητικού μεταβολισμού και την επαγωγή του προκαλούμενου από AMPK αυτοφαγικού κυτταρικού θανάτου από κανναβινοειδή

Υλικά και μέθοδοι

Υλικά

Το ACPA ελήφθη από την Cayman Chemicals (Inalco, Μιλάνο, Ιταλία). Η υδροχλωρική GW405833 (1- (2,3-διχλωροβενζοϋλ) -2-μεθυλ-3- (2- (1-μορφολινο) αιθυλ) -5-μεθοξυϊνδόλη) και NAC ( Ν -ακετυλ-ℒ-κυστεΐνη) ελήφθησαν από την Sigma ( Μιλάνο, Ιταλία); Η ένωση C (CC) ελήφθη από την Calbiochem. Το ακετονιτρίλιο, το μυρμηκικό οξύ και το νερό ποιότητας HPLC αγοράστηκαν από τη Sigma Aldrich (Μιλάνο, Ιταλία). Πρότυπα (ίση ή μεγαλύτερη από 98% χημική καθαρότητα) 6-φωσφορική glucose-γλυκόζη, 6-φωσφορική φρουκτόζη, 1,6 διφωσφορική 𝒟-φρουκτόζη, 3-φωσφορική γλυκεραλδεΰδη, φωσφονοπυρουβικό οξύ, ℒ-γαλακτικό οξύ, α-οκετογλουταρικό οξύ, ℒ-μηλικό οξύ, ηλεκτρικό οξύ, ATP, NADH, NADPH, 6-φωσφογλυκονολακτικό οξύ, ℒ-γλουταμικό οξύ, γλουταμίνη, μειωμένη γλουταθειόνη και οξειδωμένη γλουταθειόνη αγοράστηκαν από τη Sigma Aldrich.

Κυτταρικής καλλιέργειας

PANC1 κυτταρική γραμμή αναπτύχθηκε σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 2 mM γλουταμίνη, 10% FBS, και 50  μ g / ml θειική γενταμυκίνη (BioWhittaker, Lonza, Bergamo, Ιταλία), και επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO 2 .

Ανάλυση ανοσοκηλίδων

Κύτταρα (1,2 χ 106 κύτταρα / τριβλίο 10 cm) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως αναφέρθηκε στα σχήματα και μετά λύθηκαν με ρυθμιστικό RIPA για ολικό εκχύλισμα πρωτεΐνης. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με το αντιδραστήριο ανάλυσης πρωτεΐνης Bradford (Pierce, Rockford, IL, USA) χρησιμοποιώντας αλβουμίνη βόειου ορού ως πρότυπο. Σαράντα μg εκχυλισμάτων πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκε μέσω πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου και ηλεκτροτυπώθηκε σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore, Milan, Ιταλία). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με διάλυμα αποκλεισμού (5% γάλα χαμηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά σε 100 mM Tris ρΗ 7,5, 0,9% NaCl, 0,1% Tween 20) και ανιχνεύθηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C με τα πρωτογενή μονοκλωνικά αντισώματα (1 : 1000 σε διάλυμα αποκλεισμού). Ελαφριά αλυσίδα πρωτεΐνη-II (LC-3II), AMPK, phospho-AMPK Thr172, p70S6K, phopsho-p70S6K Thr389, Akt, phospho-Akt Ser473 και PDHK αποκτήθηκαν από Cell Signaling, Euroclone, Milan, Italy, HIF-1 alpha αντίσωμα από την Novus Biologs, το Μιλάνο, την Ιταλία και το α– αντίσωμα τουτουλίνης από Oncogene, Cambridge, MA, USA. Τα δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου IgG (1: 8000 σε διάλυμα αποκλεισμού, Upstate Biotechnology, DBA Italia, Milan, Italy) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση συγκεκριμένων πρωτεϊνών. Η ανοσοανίχνευση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας υποστρώματα χημειοφωταύγειας (Amersham Pharmacia Biotech, Euroclone, Μιλάνο, Ιταλία) και καταγράφηκε χρησιμοποιώντας HyperfilmECL (Amersham Pharmacia Biotech). Οι ζώνες για ολικές και φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες σαρώθηκαν ως ψηφιακές κορυφές και οι περιοχές των κορυφών υπολογίστηκαν σε αυθαίρετες μονάδες χρησιμοποιώντας το δημόσιο τομέα NIH Image software ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ) και στη συνέχεια κανονικοποιήθηκε με α– έκφραση τουμπουλίνης. Οι ποσοτικοποιήσεις ελήφθησαν ως διπλή επαγωγή σε σχέση με τους μάρτυρες και, για φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες, οι ποσοτικοποιήσεις αντιπροσωπεύουν την αναλογία φωσφορυλιωμένης / ολικής πρωτεΐνης.

Εκχύλιση μεταβολίτη

Μεταβολομική αναλύσεις μετά τη θεραπεία για 12 ώρες με 200  μ Μ GW ή ACPA και 20 mM NAC εκτελέστηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως. 41 κύτταρα παρασκευάστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο από τους Sana et al. , 42 με μικρές τροποποιήσεις όπως αναφέρθηκε προηγουμένως. 41Το δείγμα επαναιωρήθηκε με προσθήκη 0,15 ml παγωμένου εξαιρετικά καθαρού νερού (18 ΜΩ) σε κύτταρα λύσης. Οι σωλήνες βυθίστηκαν σε ξηρό πάγο ή σε λουτρό κυκλοφορίας στους -25 ° C για 0,5 λεπτά και μετά σε υδατόλουτρο στους 37 ° C για 0,5 λεπτά. Σε κάθε σωλήνα προστέθηκαν 0,6 ml −20 ° C μεθανόλης και στη συνέχεια 0,45 ml −20 ° C χλωροφορμίου. Οι σωλήνες αναμιγνύονταν κάθε 5 λεπτά για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, 0,15 ml παγωμένου εξαιρετικά καθαρού νερού ρυθμισμένου με ρΗ προστέθηκαν σε κάθε σωλήνα και αυτά φυγοκεντρήθηκαν στα 1000 × g για 1 λεπτό στους 4 ° C, πριν μεταφερθούν στους -20 ° C για 2-8 ώρες. Μετά την απόψυξη, ανακτήθηκαν υγρές φάσεις και προστέθηκε ισοδύναμος όγκος ακετονιτριλίου για να καθιζάνει οποιαδήποτε υπολειμματική πρωτεΐνη. Οι σωλήνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε ψυγείο (4 ° C) για 20 λεπτά, φυγοκεντρήθηκαν στα 10.000 × gγια 10 λεπτά στους 4 ° C και τα συλλεγέντα υπερκείμενα ξηράνθηκαν για να ληφθούν ορατά σφαιρίδια. Τελικά, τα αποξηραμένα δείγματα επανα-εναιωρήθηκαν σε 1 ml νερού, 5% μυρμηκικού οξέος και μεταφέρθηκαν σε γυάλινα φιαλίδια αυτόματης δειγματοληψίας για ανάλυση LC / MS.

HPLC αντίστροφης φάσης ταχείας ανάλυσης

Χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα Ultimate 3000 Rapid Resolution HPLC (LC Packings, DIONEX, Sunnyvale, CA, USA) για τον διαχωρισμό του μεταβολίτη. Χρησιμοποιήθηκε μια στήλη Dionex Acclaim RSLC 120 C18 2,1 mm × 150 mm × 2,2  μm για το διαχωρισμό των εκχυλισθέντων μεταβολιτών. Χρησιμοποιήθηκε γραμμική διαβάθμιση 0-95% του διαλύτη Α (0,1% μυρμηκικό οξύ σε νερό) έως Β (0,1% μυρμηκικό οξύ σε ακετονιτρίλιο) σε διάστημα 15 λεπτών ακολουθούμενη από συγκράτηση διαλύτη Β 2 λεπτών, επιστρέφοντας σε 100% Α σε 2 διατήρηση διαλύτη A και 6 λεπτά μετά τον χρόνο.

Φασματομετρία μάζας ESI

Οι μεταβολίτες εκλούστηκαν απευθείας σε ιόντα υψηλής χωρητικότητας HCTplus (Bruker-Daltonik, Βρέμη, Γερμανία). Τα φάσματα μάζας για δείγματα που εξήχθησαν από μεταβολίτη αποκτήθηκαν σε λειτουργία θετικού ιόντος. Η τριχοειδής τάση ESI ρυθμίστηκε σε λειτουργία ιόντων 3000 V (+). Ο υγρός νεφελοποιητής ρυθμίστηκε στα 30 psig και το αέριο ξήρανσης αζώτου ρυθμίστηκε σε ρυθμό ροής 9 l / min. Η θερμοκρασία ξηρού αερίου διατηρήθηκε στους 300 ° C. Τα δεδομένα αποθηκεύτηκαν σε λειτουργία κεντροειδούς. Τα εσωτερικά ιόντα αναφοράς χρησιμοποιήθηκαν για να διατηρούν συνεχώς την ακρίβεια της μάζας. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν με ρυθμό 5 φασμάτων / s με αποθηκευμένο εύρος μάζας m / z 50-1500. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό απόκτησης δεδομένων Bruker Esquire Control (v. 5.3 – build 11). Στην ανάλυση MRM, m / zτιμές ενδιαφέροντος απομονώθηκαν, κατακερματισμένες και παρακολουθήθηκαν (είτε τα γονικά είτε τα ιόντα θραύσματος) σε ολόκληρο το εύρος RT. Επικύρωση της HPLC on-line MS-εκλουσμένου μεταβολιτών διεξήχθη με τη σύγκριση των δακτυλικών αποτυπωμάτων μεταβάσεις, όταν εκτελείται η κατάτμηση και να ταιριάζουν εις βάρος των τυποποιημένων μεταβολιτών μέσω της άμεσης έγχυσης με αντλία σύριγγας (ρυθμός έγχυσης 4  μ l / min). Η τυπική βαθμονόμηση καμπύλης πραγματοποιήθηκε είτε σε πρόδρομα είτε σε σήματα ιόντων θραύσματος. Διπλές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν τόσο σε γονικά είδη όσο και σε είδη ιόντων προϊόντος και τα αποτελέσματα υιοθετήθηκαν για ποσοτικό προσδιορισμό. Οι μεταβάσεις παρακολουθήθηκαν για την επικύρωση κάθε ανιχνευμένου μεταβολίτη.

Επεξεργασία δεδομένων μεταβολίτη

Τα αρχεία δεδομένων LC / MS υποβλήθηκαν σε επεξεργασία από το λογισμικό Bruker DataAnalysis 4.0 (build 234), Μιλάνο, Ιταλία. Τα αρχεία από κάθε εκτέλεση είτε αναλύθηκαν ως αρχεία “.d” είτε εξήχθησαν ως αρχεία “.mzXML”, για περαιτέρω επεξεργασία για ευθυγράμμιση φασμάτων, κορυφαία επιλογή και ποσοτικοποίηση με το InSilicos Viewer 1.5.4 (Insilicos LLC; Seattle, WA, USA) .

Πραγματοποιήθηκαν ποσοτικές αναλύσεις πρότυπων ενώσεων σε δεδομένα MRM. Κάθε πρότυπος μεταβολίτης εκτελέστηκε εις τριπλούν, σε στοιχειώδη αραίωση έως ότου επιτευχθούν τα LOD και LOQ. Το όριο ανίχνευσης για κάθε ένωση υπολογίστηκε ως η ελάχιστη ποσότητα που εγχύθηκε που έδωσε μια απόκριση ανιχνευτή υψηλότερη από τρεις φορές την αναλογία σήματος προς θόρυβο (S / N). Η γραμμικότητα των παρατηρούμενων ποσοτήτων, των τιμών κλίσης, αναχαίτισης και γραμμικής συσχέτισης υπολογίστηκε όλα μέσω του Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA).

Ανάλυση πρόσληψης και απελευθέρωσης μεταβολίτη

Τα κύτταρα (1,2 × 10 6 / δίσκος 10 cm) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 12 ώρες με 200  μΜ GW ή ACPA. Το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας συλλέχθηκε και αναλύθηκε με Bioprofile Flex (Nova Biomedical, Waltham, ΜΑ, USA).

Ανάλυση ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα (1,6 × 10 4 ) αναπτύχθηκαν σε καλυπτρίδες και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 12 ώρες με 200  μΜ GW ή ACPA και 20  μΜ CC ή 20 mM NAC. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα GAPDH κουνελιού (1: 100) σε RT για 90 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού Alexa Fluor 488 (1: 500) σε RT για 60 λεπτά. Για να εκτιμηθεί η πυρηνική μορφολογία, τα κύτταρα επωάστηκαν με HOECHST για 2 λεπτά σε RT. Ο φθορισμός οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μήκη κύματος διέγερσης / εκπομπής 488/520 nm (πράσινο) και 350/460 nm (μπλε) για GAPDH και HOECHST, αντίστοιχα. Τα κύτταρα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας TCS-SP5 Leica confocal μικροσκόπιο, Μιλάνο, Ιταλία, σε μεγέθυνση × 40 και × 63.

Δοκιμασία δραστηριότητας PKM2

Ένα μg ολικού εκχυλίσματος πρωτεΐνης που ελήφθη από κύτταρα Panc1 που υποβλήθηκαν σε αγωγή για 12 και 24 ώρες με 200  μΜ GW ή ACPA χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της δραστικότητας PKM2 όπως αναφέρθηκε προηγουμένως. 43

Δοκιμασία δραστηριότητας c-Myc

Τα κύτταρα (4 χ 10 5 κύτταρα / τρυβλίο 6 cm) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 1, 12 ή 24 ώρες με 200  μ Μ GW ή ACPA και έπειτα λύθηκαν με κιτ πυρηνικό εκχύλισμα (Active Motif, Vinci Biochem, Φλωρεντία, Italy) για την πυρηνική και εκχυλίσματα κυτοσολικών πρωτεϊνών. Πέντε μg του πυρηνικού εκχυλίσματος χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση της δραστηριότητας c-Myc μέσω της ανάλυσης ELISA (Active Motif, TransAM, c-Myc).

Πειράματα επιμόλυνσης

Κύτταρα (2,5 χ 10 5 κύτταρα / τρυβλίο 6 cm) επιμολύνθηκαν με τον φορέα έκφρασης pcDNA5 / FRT που περιείχε την ανθρώπινη ΑΜΡΚ γάμμα-2 υπομονάδα wt ή R531G μεταλλαγμένο χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης TransIT-LT1 (Mirus Bologna, Ιταλία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Τα κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες και μετά υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 200  μΜ GW ή ACPA για 12 ώρες, για να αξιολογηθεί ο ρόλος της παραγωγής AMP στην επαγωγή AMPK. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης εκτιμήθηκε με ανάλυση κυτταροφθορομετρίας και ήταν ∼56%. Οι φορείς έκφρασης για την ΑΜΡΚ WT και μεταλλάγματος R531G γ 2 υπομονάδας παρεσχέθησαν ευγενώς από τον Dr. Hawley (Πανεπιστήμιο του Dundee, Σκωτία, Ηνωμένο Βασίλειο).

Στατιστική ανάλυση

ΑΝΟΒΑ ( post hoc Bonferroni) και γραφικές παρουσιάσεις πραγματοποιήθηκαν από το GraphPad Prism 5. Οι τιμές P * * P <0,05, ** P <0,01 ή *** P <0,001 φαίνονται στα σχήματα.

Ευχαριστίες

Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC), Μιλάνο, Ιταλία. Fondazione CariPaRo, Πάδοβα, Ιταλία; Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (PRIN, MIUR), Ρώμη, Ιταλία. Ευχαριστούμε την καθηγητή Michela Giuliano και τον καθηγητή Maurizio Bifulco για την κριτική ανάγνωση του χειρογράφου.

Γλωσσάριο

LC-MSυγρή χρωματογραφία – φασματομετρία μάζας
AMPKΕνεργοποιημένη με AMP πρωτεΐνη κινάση
ACPAαραχιδονόλιο κυκλοπροπυλαμίδιο
GWΥδροχλωρίδιο GW405833
NACΝ -ακετυλο-ℒ-κυστεΐνη
CCΈνωση Γ
GAPDHγλυκεραλδεϋδη 3-φωσφορική αφυδρογονάση
PDHKπυροσταφυλική αφυδρογονάση κινάση
ROSαντιδραστικά είδη οξυγόνου
PKM2πυροσταφυλική κινάση Μ2
CaMKK βCa2 + / εξαρτώμενη από την καλμοδουλίνη πρωτεϊνική κινάση
F6P6-φωσφορική φρουκτόζη
G6P6-φωσφορική γλυκόζη
FDP1,6-διφωσφορική φρουκτόζη
G3P3-φωσφορική γλυκεραλδεϋδη
ΖΩΝΤΑΝΙΑφωσφονοπυρουβικό εστέρα
ΛΑΚγαλακτικό
ΚΕΤάλφα-κετογλουταρικός εστέρας
SUCCηλεκτρικός
ΜΑμαλατός
ΣΔΙΤοδό φωσφορικής πεντόζης
PGLφωσφογλυκονολακτόνη

Σημειώσεις

Οι συγγραφείς δεν δηλώνουν σύγκρουση συμφερόντων.


Υποσημειώσεις

Συμπληρωματικές πληροφορίες συνοδεύουν αυτό το έγγραφο στον ιστότοπο Cell Death and Disease (http://www.nature.com/cddis)

 

Επεξεργασία από τον G Melino

βιβλιογραφικές αναφορές

  • Hermanson DJ, Cannabinoids MarnettLJ. ενδοκανναβινοειδή και καρκίνος. Καρκίνος Metastasis Αναθ. 2011; 30 : 599-612. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Διαμόρφωση συστήματος Pisanti S, Bifulco M. Endocannabinoid στη βιολογία και τη θεραπεία του καρκίνου. Pharmacol Res. 2009; 60 : 107–116. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Pisanti S, Malfitano AM, Grimaldi C, Santoro A, Gazzerro P, Laezza C, et al. Χρήση αγωνιστών υποδοχέα κανναβινοειδών στη θεραπεία καρκίνου ως ανακουφιστικών και θεραπευτικών παραγόντων. Best Clin Res Clin Ενδοκρινόλη Metab. 2009; 23 : 117–131. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Velasco G, Carracedo A, Blazquez C, Lorente M, Aguado T, Haro A, et al. Κανναβινοειδή και γλοιώματα. Mol Neurobiol. 2007; 36 : 60–67. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Qamri Z, Preet A, Nasser MW, Bass CE, Leone G, Barsky SH, et αϊ. Οι συνθετικοί αγωνιστές υποδοχέων κανναβινοειδών αναστέλλουν την ανάπτυξη όγκων και τη μετάσταση του καρκίνου του μαστού. Mol Cancer Ther. 2009; 8 : 3117-3129. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Sarfaraz S, Afaq F, Adhami VM, Mukhtar H. Cannabinoid υποδοχέας ως νέος στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. Cancer Res. 2005; 65 : 1635–1641. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Proto MC, Gazzerro P, Di Croce L, Santoro A, Malfitano AM, Pisanti S, et αϊ. Αλληλεπίδραση του συστήματος ενδοκανναβινοειδών και στεροειδών ορμονών στον έλεγχο της ανάπτυξης κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου. J Cell Physiol. 2012; 227 : 250–258. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Guindon J, Hohmann AG. Το ενδοκανναβινοειδές σύστημα και ο καρκίνος: θεραπευτικές επιπτώσεις. Br J Pharmacol. 2011; 163 : 1447–1463. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • De Petrocellis L, Melck D, Palmisano A, Bisogno T, Laezza C, Bifulco Μ, et αϊ. Το ενδογενές κανναβινοειδές ανναδαμίδιο αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του μαστού στον άνθρωπο. Proc Natl Acad Sci ΗΠΑ. 1998; 95 : 8375-8380. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Donadelli M, Dando I, Zaniboni T, Costanzo C, Dalla Pozza E, Scupoli MT, et al. Ο συνδυασμός γεμσιταβίνης / κανναβινοειδών προκαλεί αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος μέσω ενός μηχανισμού μεσολαβούμενου από ROS. Cell Death Dis. 2011; 2 : e152. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Salazar M, Carracedo A, Salanueva IJ, Hernandez-Tiedra S, Lorente M, Egia A, et al. Η δράση των κανναβινοειδών προκαλεί κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από αυτοφαγία μέσω διέγερσης του στρες ER σε κύτταρα ανθρώπινου γλοιώματος. J Clin Invest. 2009; 119 : 1359–1372. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Yu L, McPhee CK, Zheng L, Mardones GA, Rong Y, Peng J, et al. Τερματισμός της αυτοφαγίας και αναμόρφωση των λυσοσωμάτων που ρυθμίζονται από το mTOR. Φύση. 2010; 465 : 942–946. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Levine B. Κυτταρική βιολογία: αυτοφαγία και καρκίνος. Φύση. 2007; 446 : 745-747. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Vara D, Salazar M, Olea-Herrero N, Guzman M, Velasco G, Diaz-Laviada I. Αντικαρκινική δράση των κανναβινοειδών στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα: ρόλος της εξαρτώμενης από AMPK ενεργοποίησης της αυτοφαγίας. Κυτταρικός θάνατος διαφέρει. 2011; 18 : 1099–1111. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Hardie ΓΔ. AMP-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση: ένας αισθητήρας ενέργειας που ρυθμίζει όλες τις πτυχές της κυτταρικής λειτουργίας. Genes Dev. 2011; 25 : 1895–1908. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Hawley SA, Boudeau J, Reid JL, Mustard KJ, Udd L, Makela TP, et αϊ. Τα σύμπλοκα μεταξύ του καταστολέα όγκου LKB1, του STRAD άλφα / βήτα και του MO25 άλφα / βήτα είναι ανοδικά κινάσες στον καταρράκτη πρωτεϊνικής κινάσης που ενεργοποιείται με AMP. J Biol. 2003; 2 : 28. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Shaw RJ, Kosmatka M, Bardeesy N, Hurley RL, Witters LA, DePinho RA, et al. Η καρκινική καταστολέα όγκου LKB1 ενεργοποιεί άμεσα την ενεργοποιημένη με AMP κινάση και ρυθμίζει την απόπτωση σε απόκριση στο ενεργειακό στρες. Proc Natl Acad Sci ΗΠΑ. 2004; 101 : 3329–3335. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Woods A, Johnstone SR, Dickerson K, Leiper FC, Fryer LG, Neumann D, et αϊ. Το LKB1 είναι η ανοδική κινάση στον καταρράκτη πρωτεϊνικής κινάσης ενεργοποιημένης με AMP. Curr ΒίοΙ. 2003; 13 : 2004–2008. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Sakamoto K, Goransson O, Hardie DG, Alessi DR. Δραστηριότητα των κινασών που σχετίζονται με LKB1 και AMPK στον σκελετικό μυ: επιπτώσεις συστολής, φαινφορμίνης και AICAR. Am J Physiol Ενδοκρινόλη Metab. 2004; 287 : E310 – E317. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Hawley SA, Pan DA, Mustard KJ, Ross L, Bain J, Edelman AM, et al. Η εξαρτώμενη από Calmodulin πρωτεϊνική κινάση-βήτα είναι μια εναλλακτική ανοδική κινάση για ενεργοποιημένη με AMP πρωτεϊνική κινάση. Cell Metab. 2005; 2 : 9–19. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Hurley RL, Anderson KA, Franzone JM, Kemp BE, Means AR, Witters LA. Οι εξαρτώμενες από Ca2 + / κινδοδουλινικές πρωτεϊνικές κινάσες κινάσης είναι ενεργοποιημένες με AMP πρωτεϊνικές κινάσες. J Biol Chem. 2005; 280 : 29060-29066. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Woods A, Dickerson K, Heath R, Hong SP, Momcilovic M, Johnstone SR, et αϊ. Η πρωτεΐνη κινάση-βήτα-εξαρτώμενη από Ca2 + / καλμοδουλίνη-βήτα δρα πριν από την ενεργοποιημένη με AMP πρωτεϊνική κινάση σε κύτταρα θηλαστικών. Cell Metab. 2005; 2 : 21–33. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Fogarty S, Hawley SA, Green KA, Saner N, Mustard KJ, Hardie DG. Η εξαρτώμενη από Calmodulin πρωτεΐνη κινάση-βήτα ενεργοποιεί το AMPK χωρίς να σχηματίζει ένα σταθερό σύμπλοκο: συνεργιστικές επιδράσεις των Ca2 + και AMP. Biochem J. 2010; 426 : 109–118. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Zhou G, Myers R, Li Y, Chen Y, Shen X, Fenyk-Melody J, et αϊ. Ο ρόλος της ενεργοποιημένης με AMP πρωτεϊνικής κινάσης στον μηχανισμό δράσης της μετφορμίνης. J Clin Invest. 2001; 108 : 1167–1174. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Colell A, Ricci JE, Tait S, Milasta S, Maurer U, Bouchier-Hayes L, et αϊ. Η GAPDH και η αυτοφαγία διατηρούν την επιβίωση μετά την αποπτωτική απελευθέρωση του κυτοχρώματος c απουσία ενεργοποίησης της κασπάσης. Κύτταρο. 2007; 129 : 983–997. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Kroemer G, Pouyssegur J. Μεταβολισμός κυττάρων όγκων: καρκίνου του Αχιλλέα. Καρκινικό κύτταρο. 2008; 13 : 472–482. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Wise DR, DeBerardinis RJ, Mancuso A, Sayed N, Zhang XY, Pfeiffer HK, et αϊ. Το Myc ρυθμίζει ένα μεταγραφικό πρόγραμμα που διεγείρει τη μιτοχονδριακή γλουταμινόλυση και οδηγεί σε εθισμό στη γλουταμίνη. Proc Natl Acad Sci ΗΠΑ. 2008; 105 : 18782–18787. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Castellino RC, Durden DL. Μηχανισμοί νόσου: ο κόμβος σηματοδότησης PI3K-Akt-PTEN – σημείο αναχαίτισης για τον έλεγχο της αγγειογένεσης σε όγκους του εγκεφάλου. Nat Clin Pract Neurol. 2007; 3 : 682–693. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Fleming A, Noda T, Yoshimori T, Rubinsztein DC. Χημικοί ρυθμιστές της αυτοφαγίας ως βιολογικοί ανιχνευτές και πιθανές θεραπευτικές. Nat Chem Biol. 2011; 7 : 9–17. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Wang S, Song P, Zou MH. Ενεργοποιημένη με AMP πρωτεϊνική κινάση, αποκρίσεις στο στρες και καρδιαγγειακές παθήσεις. Clin Sci (Lond) 2012; 122 : 555–573. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Lamberts RR, Onderwater G, Hamdani N, Vreden MJ, Steenhuisen J, Eringa EC, et αϊ. Η διέγερση που προκαλείται από αντιδραστικό είδος οξυγόνου της ενεργοποιημένης πρωτεΐνης κινάσης 5’AMP προκαλεί καρβοπροστασία που προκαλείται από σεβοφλουράνιο. Κυκλοφορία. 2009; 120 : S10 – S15. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Οι Shrivastava A, Kuzontkoski PM, Groopman JE, Prasad A. Cannabidiol προκαλούν προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα καρκίνου του μαστού συντονίζοντας τη διασταυρούμενη συζήτηση μεταξύ της απόπτωσης και της αυτοφαγίας. Mol Cancer Ther. 2011; 10 : 1161–1172. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Murray J, Taylor SW, Zhang B, Ghosh SS, Capaldi RA. Οξειδωτική βλάβη στο μιτοχονδριακό σύμπλοκο Ι λόγω υπεροξυνιτρώδους: αναγνώριση αντιδραστικών τυροσινών με φασματομετρία μάζας. J Biol Chem. 2003; 278 : 37223–37230. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Colell A, Green DR, Ricci JE. Νέοι ρόλοι για το GAPDH στον κυτταρικό θάνατο και την καρκινογένεση. Κυτταρικός θάνατος διαφέρει. 2009; 16 : 1573–1581. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Dando I, Fiorini C, Pozza ED, Padroni C, Costanzo C, Palmieri M, et al. Η αναστολή UCP2 πυροδοτεί την εξαρτώμενη από ROS πυρηνική μετατόπιση του GAPDH και τον αυτοφαγικό θάνατο των κυττάρων σε κύτταρα παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. Biochim Biophys Acta. 2013; 1833 : 672–679. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Kwon HJ, Rhim JH, Jang IS, Kim GE, Park SC, Yeo EJ. Η ενεργοποίηση της ενεργοποιημένης με AMP πρωτεϊνικής κινάσης διεγείρει τον πυρηνικό εντοπισμό της 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης γλυκεραλδεΰδης σε ανθρώπινους διπλοειδείς ινοβλάστες. Exp Mol Med. 2010; 42 : 254–269. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Cairns RA, Harris IS, Mak TW. Ρύθμιση του μεταβολισμού των καρκινικών κυττάρων. Nat Rev Καρκίνος. 2011; 11 : 85–95. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Hitosugi T, Kang S, Vander Heiden MG, Chung TW, Elf S, Lythgoe K, et al. Η φωσφορυλίωση τυροσίνης αναστέλλει το PKM2 για την προώθηση της επίδρασης Warburg και της ανάπτυξης όγκων. Σήμα Sci. 2009;2 : ra73. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • David CJ, Chen M, Assanah M, Canoll P, Manley JL. Πρωτεΐνες HnRNP ελεγχόμενες με μάτισμα mRNA πυροσταφυλικής κινάσης c-Myc deregulate σε καρκίνο. Φύση. 2010;463 : 364–368. [ Δωρεάν άρθρο PMC ] [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Aquila S, Guido C, Santoro A, Perrotta I, Laezza C, Bifulco M, et al. Ανατομία ανθρώπινου σπέρματος: υπερδομικός εντοπισμός του υποδοχέα κανναβινοειδούς1 και πιθανός ρόλος της ανανδαμίδης στην επιβίωση του σπέρματος και την αντίδραση ακροσωμάτων.Anat Rec (Hoboken) 2010; 293 : 298–309. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • D’Alessandro A, Gevi F, Zolla L. Μια ισχυρή στρατηγική HPLC αντίστροφης φάσης υψηλής ανάλυσης για τη διερεύνηση διαφόρων μεταβολικών ειδών σε διαφορετικά βιολογικά μοντέλα. Mol Biosyst. 2011; 7 : 1024-1032. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Sana TR, Waddell K, Fischer SM. Ένα δείγμα εξαγωγής και χρωματογραφικής στρατηγικής για αύξηση της κάλυψης ανίχνευσης LC / MS του μεταβολώματος των ερυθροκυττάρων.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2008; 871 : 314–321. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]
  • Christofk HR, Vander Heiden MG, Wu N, Asara JM, Cantley LC. Η πυροσταφυλική κινάση Μ2 είναι μια πρωτεΐνη που δεσμεύει φωσφοτυροσίνη. Φύση. 2008; 452 : 181–186. [ PubMed ] [ Μελετητής Google ]

Τα άρθρα από το Cell Death & Disease παρέχονται εδώ με την ευγένεια του Nature Publishing Group

ΔΙΑΔΩΣΤΕ ΤΗ ΓΝΩΣΗ

Αφήστε μια απάντηση

Η ηλ. διεύθυνση σας δεν δημοσιεύεται. Τα υποχρεωτικά πεδία σημειώνονται με *

*

Αυτός ο ιστότοπος χρησιμοποιεί το Akismet για να μειώσει τα ανεπιθύμητα σχόλια. Μάθετε πώς υφίστανται επεξεργασία τα δεδομένα των σχολίων σας.

Top