Κανναβινοειδή Θανατώνουν Κύτταρα Ανθρώπινου Γλοιώματος
- J Clin Invest
- v.119 (5); 2009 1 Μαΐου
- PMC2673842
Η δράση των κανναβινοειδών προκαλεί θάνατο κυττάρων που προκαλείται από αυτοφαγία μέσω διέγερσης του στρες ER σε κύτταρα ανθρώπινου γλοιώματος
Συσχετισμένα δεδομένα
Περίληψη
Η αυτοφαγία μπορεί να προωθήσει την κυτταρική επιβίωση ή τον κυτταρικό θάνατο, αλλά η μοριακή βάση που διέπει τον διπλό ρόλο της στον καρκίνο παραμένει ασαφής. Εδώ αποδεικνύουμε ότι Δ 9-Η τετραϋδροκανναβινόλη (THC), το κύριο δραστικό συστατικό της μαριχουάνας, προκαλεί θάνατο ανθρώπινου γλοιώματος μέσω διέγερσης αυτοφαγίας. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η THC προκάλεσε συσσώρευση κεραμιδίου και φωσφορυλίωση παράγοντα 2α (eIF2α) και προκαλεί μια απόκριση ER στο στρες που προήγαγε την αυτοφαγία μέσω τριφυλλιού αναστολής 3 εξαρτώμενων από το ομόλογο (εξαρτώμενο από το TRB3) του στόχου Akt / θηλαστικού του συμπλέγματος ραπαμυκίνης 1 (mTORC1) άξονας. Δείξαμε επίσης ότι η αυτοφαγία βρίσκεται πριν από την απόπτωση στον κυτταρικό θάνατο καρκίνου ανθρώπου και ποντικού που προκαλείται από κανναβινοειδή και ότι η ενεργοποίηση αυτής της οδού ήταν απαραίτητη για την αντικαρκινική δράση των κανναβινοειδών in vivo.Αυτά τα ευρήματα περιγράφουν έναν μηχανισμό με τον οποίο η THC μπορεί να προωθήσει τον αυτοφαγικό θάνατο ανθρώπινων και ποντικών καρκινικών κυττάρων και να αποδείξει ότι η χορήγηση κανναβινοειδών μπορεί να είναι μια αποτελεσματική θεραπευτική στρατηγική για τη στόχευση καρκίνων στον άνθρωπο.
Εισαγωγή
Η μακρο-αυτοφαγία, στο εξής αναφερόμενη ως «αυτοφαγία», είναι μια εξαιρετικά συντηρημένη κυτταρική διαδικασία στην οποία τα κυτταροπλασματικά υλικά – συμπεριλαμβανομένων των οργανίων – αποκολλούνται σε κυστίδια διπλής μεμβράνης που ονομάζονται αυτοφαγοσώματα και παραδίδονται σε λυσοσώματα για αποικοδόμηση ή ανακύκλωση ( 1 ). Σε πολλές κυτταρικές ρυθμίσεις, η ενεργοποίηση της αυτοφαγίας βασίζεται στην αναστολή στόχου θηλαστικών του συμπλέγματος ραπαμυκίνης 1 (mTORC1), ένα γεγονός που προάγει την ενεργοποίηση (απο-αναστολή) αρκετών πρωτεϊνών αυτοφαγίας (Atgs) που εμπλέκονται στην αρχική φάση της απομόνωσης μεμβράνης ( 1). Η διεύρυνση αυτού του συμπλόκου για το σχηματισμό του αυτοφαγοσώματος απαιτεί τη συμμετοχή 2 συστημάτων σύζευξης που μοιάζουν με ουμπικιτίνη. Το ένα περιλαμβάνει τη σύζευξη του ATG12 σε ATG5 και το άλλο της φωσφατιδυλαιθανολαμίνης σε LC3 / ATG8 ( 1 ). Το τελικό αποτέλεσμα της ενεργοποίησης του προγράμματος αυτοφαγίας εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το κυτταρικό πλαίσιο και τη δύναμη και τη διάρκεια των σημάτων που προκαλούν στρες ( 2 – 5 ). Έτσι, εκτός από τον ρόλο του στην κυτταρική ομοιόσταση, η αυτοφαγία μπορεί να είναι μια μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, που ορίζεται ως «προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος τύπου II», ή να παίζει κυτταροπροστατευτικό ρόλο, για παράδειγμα σε καταστάσεις λιμοκτονίας θρεπτικών ουσιών ( 6)). Κατά συνέπεια, η αυτοφαγία έχει προταθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο τόσο στην πρόοδο του όγκου όσο και στην προώθηση του θανάτου από καρκινικά κύτταρα ( 2 – 4 ), αν και οι μοριακοί μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για αυτή τη διπλή δράση της αυτοφαγίας στον καρκίνο δεν έχουν διευκρινιστεί.
Δ 9 -Τετραϋδροκανναβινόλη (THC), το κύριο δραστικό συστατικό της μαριχουάνας ( 7 ), ασκεί μεγάλη ποικιλία βιολογικών επιδράσεων μιμούμενοι ενδογενείς ουσίες – τα ενδοκανναβινοειδή – που συνδέονται και ενεργοποιούν συγκεκριμένους υποδοχείς κανναβινοειδών ( 8 ). Ένας από τους πιο συναρπαστικούς τομείς έρευνας στον τομέα των κανναβινοειδών είναι η μελέτη της πιθανής εφαρμογής των κανναβινοειδών ως αντικαρκινικών παραγόντων ( 9 ). Η χορήγηση κανναβινοειδών έχει βρεθεί ότι περιορίζει την ανάπτυξη διαφόρων τύπων ξενομοσχευμάτων όγκων σε αρουραίους και ποντίκια ( 9 , 10). Με βάση αυτά τα προκλινικά στοιχεία, πρόσφατα διεξήχθη πιλοτική κλινική δοκιμή για τη διερεύνηση της αντικαρκινικής δράσης της THC σε υποτροπιάζοντα γλοιώματα ( 11 ). Πρόσφατα ευρήματα έχουν δείξει επίσης ότι η προ-αποπτωτική και ανασταλτική ανάπτυξη όγκου δραστηριότητα των κανναβινοειδών βασίζεται στην αναπροσαρμογή του μεταγραφικού συν-ενεργοποιητή p8 ( 12 ) και στοχεύει στον ψευδο-κινάση tribbles homolog 3 (TRB3) ( 13). Ωστόσο, οι μηχανισμοί που προωθούν την ενεργοποίηση αυτής της οδού σηματοδότησης καθώς και τους στόχους κατάντη του TRB3 που μεσολαβούν στη δράση του για τη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων παραμένουν αόριστοι. Σε αυτή τη μελέτη διαπιστώσαμε ότι το ER προκαλούσε αυξημένη ρύθμιση της οδού p8 / TRB3 προκάλεσε αυτοφαγία μέσω αναστολής του άξονα Akt / mTORC1 και ότι η ενεργοποίηση της αυτοφαγίας προήγαγε τον αποπτωτικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων. Η αποκάλυψη αυτού του μονοπατιού, που πιστεύουμε ότι είναι καινοτόμο, για την προώθηση του θανάτου των καρκινικών κυττάρων μπορεί να έχει θεραπευτικές επιπτώσεις στη θεραπεία του καρκίνου.
Αποτελέσματα
Η αυτοφαγία μεσολαβεί στον θάνατο καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από THC.
Ως μια πρώτη προσέγγιση για να αποκτήσουμε γνώση των μορφολογικών αλλαγών που προκαλούνται στα καρκινικά κύτταρα με χορήγηση κανναβινοειδών, πραγματοποιήσαμε ανάλυση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας κυττάρων ανθρώπινου αστροκυτώματος U87MG. Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήθηκαν διπλές μεμβράνες κενοειδείς δομές με τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των αυτοφαγοσωμάτων σε κύτταρα που έλαβαν THC (Εικόνα(Φιγούρα 1,1, ΜΕΤΑ ΧΡΙΣΤΟΝ). Η μετατροπή της διαλυτής μορφής LC3 (LC3-I) σε λιπιδιωμένη και σχετιζόμενη με αυτοφαγοσωματική μορφή (LC3-II) θεωρείται ένα από τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα της αυτοφαγίας ( 1 ), και έτσι παρατηρήσαμε την εμφάνιση θετικών σημείων LC3 ως καθώς και την εμφάνιση του LC3-II (Εικόνα(Σχήμα 1D)1D) σε κύτταρα που προκαλούνται από κανναβινοειδή. Επιπλέον, η συν-επώαση με τους αναστολείς της λυσοσωμικής πρωτεάσης E64d και της πεπτατίνης Α, που μπλοκάρει τα τελευταία στάδια της αυτοφαγικής αποδόμησης ( 14 ), ενίσχυσε την επαγόμενη από THC συσσώρευση του LC3-II (Εικόνα(Σχήμα 1Ε),1Ε), επιβεβαιώνοντας ότι τα κανναβινοειδή προκαλούν δυναμική αυτοφαγία σε κύτταρα U87MG. Επιπλέον, η επώαση με τον ανταγωνιστή κανναβινοειδούς υποδοχέα 1 (CB1) SR141716 απέτρεψε την επαγόμενη από THC λιπιδίωση LC3 και το σχηματισμό κουκκίδων LC3 (Εικόνα(Σχήμα 1D),1Δ), υποδεικνύοντας ότι η πρόκληση αυτοφαγίας από κανναβινοειδή βασίζεται στην ενεργοποίηση του υποδοχέα CB1.
( A – C ) Επίδραση της THC στη μορφολογία κυττάρων U87MG. Εμφανίζονται αντιπροσωπευτικές φωτομικρογραφίες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (6 ώρες). Ράβδοι κλίμακας: 500 nm. Σημειώστε την παρουσία πρώιμων ( Α , ανοιχτών βελών και Β ) και αργά ( Α , γεμάτα βέλη και C ) αυτοφαγοσωμάτων σε κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με THC αλλά όχι σε κύτταρα (που έχουν υποστεί αγωγή με οχήματα). ( Δ ) Κορυφή: Επίδραση SR141716 (SR1; 1 μM) και THC στην ανοσοχρώση LC3 (πράσινο) σε κύτταρα U87MG (18 ώρες; n= 3). Το ποσοστό των κελιών με κουκκίδες LC3 σε σχέση με τον συνολικό αριθμό κελιού εμφανίζεται στη γωνία κάθε πίνακα (μέσος όρος ± SD). Ράβδος κλίμακας: 20 μm. Κάτω: Επίδραση των SR1 και THC στην λιπιδίωση LC3 σε κύτταρα U87MG (18 ώρες, η = 3). ( E ) Επίδραση της E64d (10 μM) και της πεπτατίνης Α (PA, 10 μg / ml) στην επαγόμενη από THC λιπιδίωση LC3 σε κύτταρα U87MG (18 ώρες, n = 3). ( F και G ) Επίδραση της θεραπείας THC και της επιμόλυνσης με siRNA ελέγχου (siC) ή ATG1-επιλεκτικά siRNAs (siATG1) στην κυτταρική βιωσιμότητα ( F ; μέσος όρος ± SD; n= 3), LC3 ανοσοχρώση ( G , αριστερά πλαίσια, 18 ώρες; ποσοστό κυττάρων με κουκκίδες LC3 σε σχέση με τον συνολικό αριθμό κυττάρων που έχουν διαμολυνθεί με κόκκινο φθορίζον siRNA ελέγχου, μέσος όρος ± SD; n = 3; γραμμή κλίμακας: 20 μm) , και LC3 λιπιδίωση ( G , δεξί πλαίσιο, 18 ώρες, n = 3) σε κύτταρα U87MG. ( H και I ) Επίδραση της THC στη βιωσιμότητα των κυττάρων ( H ; μέσος όρος ± SD; n = 3), LC3 ανοσοχρώση ( I, αριστερά πάνελ. 18 ώρες; ποσοστό κελιών με κουκκίδες LC3 σε σχέση με τον συνολικό αριθμό κυττάρων, μέσος όρος ± SD; n = 3; ράβδος κλίμακας: 20 μm), και λιπιδίωση LC3 ( I , δεξί πλαίσιο; 18 ώρες; n = 3) σε MEFs Atg5 + / + και Atg5 – / – Ras V12 / T-large. * P < 0,05 και ** P < 0,01 σε σύγκριση με U87MG ( D ) και Atg5 + / + ( H και I)) και συγκρίθηκε με siC-επιμολυσμένα, THC-κατεργασμένα U87MG κύτταρα ( F και G ). Η συγκέντρωση THC ήταν 6 μM.
Δεδομένου ότι η αυτοφαγία έχει εμπλακεί στην προώθηση και την αναστολή της επιβίωσης των κυττάρων, στη συνέχεια διερευνήσαμε τη συμμετοχή της στη δράση του THC που προκαλεί θάνατο από καρκινικά κύτταρα. Φαρμακολογική αναστολή της αυτοφαγίας σε διαφορετικά επίπεδα (Συμπληρωματικό Σχήμα 1, A-C. Συμπληρωματικό υλικό διαθέσιμο διαδικτυακά με αυτό το άρθρο; doi: 10.1172 / JCI37948DS1) ή επιλεκτική νοκ-άουτ του ATG1 (μια απαραίτητη πρωτεΐνη στην έναρξη της αυτοφαγίας · αναφορά 1 ) ( Φιγούρα(Φιγούρα 1,1, F και G), ATG5 (μια βασική πρωτεΐνη στο σχηματισμό του αυτοφαγοσώματος, αναφ. 1 ) (Συμπληρωματικό Σχήμα 1, D-F) ή AMBRA1 (μια πρόσφατα αναγνωρισμένη πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης beclin-1 που ρυθμίζει την αυτοφαγία, αναφ. 15 ) (Συμπληρωματικό Σχήμα 1, D-F) μείωσε έντονα την αυτοφαγία που προκαλείται από κανναβινοειδή και τον κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, οι μετασχηματισμένοι εμβρυϊκοί ινοβλάστες ποντικού με ανεπάρκεια Atg5 (MEF), οι οποίοι είναι ελαττωματικοί στην αυτοφαγία ( 16 ), ήταν πιο ανθεκτικοί από τους αντίστοιχους άγριου τύπου στον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από THC (Εικόνα(Σχήμα 1Η)1Η) και δεν υπέστη αυτοφαγία κατά τη θεραπεία με κανναβινοειδή (Σχήμα (Σχήμα 1Ι).1ΕΓΩ). Συνολικά, αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι η αυτοφαγία παίζει εξέχοντα ρόλο στον θάνατο από καρκινικά κύτταρα που προκαλείται από THC.
Η THC προκαλεί αυτοφαγία μέσω ER που εξαρτάται από το άγχος, υπερβολική ρύθμιση των p8 και TRB3.
Εκτός από την παρουσία αυτοφαγοσωμάτων, η ανάλυση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας κυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με κανναβινοειδή αποκάλυψε την παρουσία πολυάριθμων κυττάρων με διασταλμένο ER (Εικόνα (Σχήμα 2Α).2ΕΝΑ). Σύμφωνα με αυτήν την παρατήρηση, η ανοσοχρώση της ισομεράσης δισουλφιδικής πρωτεΐνης ER αυλού δείκτη (PDI) έδειξε εντυπωσιακή διαστολή στο ER των κυττάρων U87MG που υποβλήθηκαν σε αγωγή με THC (Εικόνα(Σχήμα 2Β),2Β), ένα συμβάν που συσχετίστηκε με αυξημένη φωσφορυλίωση της α υπομονάδας του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης μετάφρασης 2 (eIF2α), χαρακτηριστικό της απόκρισης στο στρες ER ( 17 )(Σχήμα 2C).2ΝΤΟ). Επιπλέον, η διαστολή ER που προκαλείται από THC και η φωσφορυλίωση eIF2α παρεμποδίστηκαν με φαρμακολογικό αποκλεισμό του υποδοχέα CB1 (Εικόνα(Σχήμα 2,2, Β και Γ).
( Α ) Επίδραση της THC στη μορφολογία κυττάρων U87MG. Σημειώστε την παρουσία του διασταλμένου ER σε κύτταρα THC- αλλά όχι σε οχήματα (6 ώρες). Τα βέλη δείχνουν το ER. Ράβδοι κλίμακας: 500 nm. ( B ) Επίδραση SR1 (1 μM) και THC στην ανοσοχρώση PDI (ερυθρό) σε κύτταρα U87MG (8 ώρες, n = 3). Το ποσοστό των κελιών με τελείες PDI σε σχέση με τον συνολικό αριθμό κελιού εμφανίζεται στη γωνία κάθε πίνακα (μέσος όρος ± SD). Ράβδος κλίμακας: 20 μm. ( C ) Επίδραση του SR1 (1 μM) στη φωσφορυλίωση eIF2α που προκαλείται από THC κυττάρων U87MG (3 ώρες, OD σε σχέση με κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα, μέσος όρος ± SD, n = 3). (Δ ) Επίδραση της THC σε PDI (ερυθρό) και LC3 (πράσινο) ανοσοχρώση σε κύτταρα U87MG ( n = 3). Εμφανίζεται το ποσοστό των κελιών με PDI ή LC3 κουκκίδες σε σχέση με τον συνολικό αριθμό κυττάρων σε κάθε χρονικό σημείο (μέσος όρος ± SD). Ράβδος κλίμακας: 20 μm. ( Ε ) Επίδραση της THC στη φωσφορυλίωση eIF2α και την λιπιδίωση LC3 σε κύτταρα U87MG ( η = 3). ** P < 0,01 σε σύγκριση με τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με THC ( B ) ή σε κύτταρα ( C και D ).
Ανάλυση χρονικής πορείας των ανοσοχρώσεων PDI και LC3, φωσφορυλίωσης eIF2α και λιπίδωσης LC3 κυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με κανναβινοειδή αποκάλυψε ότι το στρες ER εμφανίστηκε νωρίτερα από την αυτοφαγία (Εικόνα (Σχήμα 2,2, D και E). Ενδιαφέρον, η χορήγηση κανναβινοειδών παρήγαγε παρόμοια ενεργοποίηση του στρες ER και της αυτοφαγίας, καθώς και του κυτταρικού θανάτου, σε άλλες κυτταρικές σειρές ανθρώπινου αστροκυτώματος (Συμπληρωματικό Σχήμα 2, A-F), μια κύρια καλλιέργεια ανθρώπινων κυττάρων γλοιώματος (Συμπληρωματικό Σχήμα 2, G– I), και πολλές κυτταρικές σειρές καρκίνου ανθρώπου διαφορετικής προέλευσης, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος (Συμπληρωματικό Σχήμα 2, J-L), του καρκίνου του μαστού και του ηπατώματος (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Ωστόσο, ούτε η διαστολή ER ούτε η φωσφορυλίωση eIF2α ή η αυτοφαγία ήταν εμφανή σε φυσιολογικά, μη μετασχηματισμένα πρωτογενή αστροκύτταρα (Συμπληρωματικό Σχήμα 3), τα οποία είναι ανθεκτικά στον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από κανναβινοειδή ( 13 ).
Στη συνέχεια διερευνήσαμε εάν η ενεργοποίηση του στρες ER εμπλέκεται στην πρόκληση αυτοφαγίας σε απόκριση στη θεραπεία με κανναβινοειδή καρκινικών κυττάρων. Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι η συσσώρευση προκαλούμενη από THC de novo-synthesized ceramide, ένα συμβάν που συμβαίνει στο ER ( 18 ), οδηγεί σε αύξηση της ρύθμισης της πίεσης πρωτεΐνης p8 και των ER που σχετίζεται με το άγχος, κατάντη στόχων, ATF4, CHOP, και TRB3, για την πρόκληση θανάτου από καρκινικά κύτταρα ( 13 ). Είναι σημαντικό, η επώαση με ISP-1 (ένας εκλεκτικός αναστολέας της σερίνης παλμιτοϋλτρανσφεράσης, το ένζυμο που καταλύει το πρώτο βήμα της βιοσύνθεσης της σφιγγολιπιδικής · αναφορά 18πρόληψη συσσώρευσης κεραμιδίου (Συμπληρωματικό Σχήμα 4Α) Διαστολή ER που προκαλείται από THC (Συμπληρωματικό Σχήμα 4Β). φωσφορυλίωση eIF2α (Σχήμα(Σχήμα 3Α);3ΕΝΑ); Ρ8, ATF4, CHOP και TRB3 προς τα πάνω ρύθμιση (Συμπληρωματικό Σχήμα 4C); και αυτοφαγία (Εικόνα(Σχήμα 3Β),3Β), υποστηρίζοντας ότι η συσσώρευση κεραμιδίου εμπλέκεται στο στρες ER και την αυτοφαγία που προκαλείται από κανναβινοειδή. Επαληθεύσαμε επίσης μέσω παρεμβολής RNA ότι το CaCMKKβ – το οποίο είχε προηγουμένως εμπλακεί στην ενεργοποίηση της αυτοφαγίας σε απόκριση στην απελευθέρωση ασβεστίου που σχετίζεται με το άγχος ER ( 19 ) – δεν συμμετείχε σε αυτοφαγία που προκαλείται από THC και κυτταρικό θάνατο (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Καθώς η φωσφορυλίωση του eIF2a στο Ser51 εξασθενεί τη γενική σύνθεση πρωτεϊνών ενώ ενισχύει την έκφραση πολλών γονιδίων απόκρισης στο στρες ER ( 17, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα που προέρχονται από ποντίκια νοκκίν eIF2α S51A για να ελέγξουμε εάν η φωσφορυλίωση eIF2a ρυθμίζει την έκφραση του ρ8 και τους κατάντη στόχους του. Σε συμφωνία με αυτήν την υπόθεση, η θεραπεία με THC (η οποία προήγαγε τη συσσώρευση κεραμιδίου τόσο σε άγριου τύπου όσο και σε eIF2α S51A αθανατοποιημένες MEFs, Συμπληρωματικό Σχήμα 5Α) πυροδότησε την αύξηση των ρυθμίσεων p8, ATF4, CHOP και TRB3 (Εικόνα(Σχήμα 3C)3C) καθώς και αυτοφαγία (Συμπληρωματικό Σχήμα 5Β) σε κύτταρα άγριου τύπου αλλά όχι στα αντίστοιχα eIF2α S51A.
( Α και Β ) Επίδραση του ISP-1 (1 μM) στην επαγόμενη από THC φωσφορυλίωση eIF2α ( A ; 3 h; n = 3) και LC3 ανοσοχρώση ( B , αριστερά πλαίσια; 18 ώρες; ποσοστό κυττάρων με κουκκίδες LC3 σε σχέση με ο συνολικός αριθμός κυττάρων, μέσος όρος ± SD; n = 3; γραμμή κλίμακας: 20 μm) σε κύτταρα U87MG. sip8, p8-επιλεκτικό siRNA; siTRB3, TRB3-επιλεκτικό siRNA. ( C ) Επίδραση THC στα επίπεδα m8 του p8, ATF4, CHOP και TRB3 των eIF2a WT και eIF2a S51A MEFs όπως προσδιορίζεται από ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (8 ώρες; n= 3). Οι αριθμοί υποδηλώνουν τη μέση αύξηση της πτυχής ± SD σε σχέση με τα MIFs eIF2a WT που έχουν υποστεί επεξεργασία με όχημα. ( D ) Κορυφή: Ανάλυση των επιπέδων mRNA p8 και TRB3. Εμφανίζονται τα αποτελέσματα από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα RT-PCR. Οι αριθμοί υποδεικνύουν επίπεδα γονιδιακής έκφρασης όπως προσδιορίζονται από ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (μέση μεταβολή πτυχών ± SD σε σχέση με siC-επιμολυσμένα κύτταρα · n = 5). Κάτω: Επίδραση του THC στην ανοσοχρώση LC3 (πράσινο) κυττάρων U87MG επιμολυσμένα με siC, sip8 ή siTRB3 (18 h; n= 4). Το ποσοστό των κυττάρων με κουκκίδες LC3 σε σχέση με τα κύτταρα που διαμολύνθηκαν με ένα κόκκινο φθορίζον siRNA ελέγχου δείχνεται σε κάθε πλαίσιο (μέσος όρος ± SD). Ράβδος κλίμακας: 20 μm. ( Ε ) Επίδραση THC στην λιπιδίωση LC3 σε κύτταρα U87MG επιμολυσμένα με siC, sip8 ή siTRB3 (18 ώρες, η = 6). ( F ) Επίδραση της THC στην λιπιδίωση LC3 (κορυφή; 18 ώρες; n = 5) και την ανοσοχρώση LC3 (πυθμένα; 18 ώρες. Ποσοστό κυττάρων με κουκκίδες LC3 σε σχέση με τον συνολικό αριθμό κυττάρων, μέσος όρος ± SD; n = 4; κλίμακα bar: 40 μm) σε p8 + / + ή p8– / – MEF. * P < 0,05 και ** P < 0,01 σε σύγκριση μεκύτταραU87MG ( B ), eIF2α WT ( C ) ή p8 + / + ( F ) πουυποβλήθηκαν σε αγωγή με THCκαι συγκρίθηκαν με κύτταρα με επιμόλυνση με siC, U87MG ( D ) .
Στη συνέχεια ρωτήσαμε εάν το p8 και οι κατάντη στόχοι του ρυθμίζουν την αυτοφαγία. Η καταστολή του p8 ή του TRB3 απέτρεψε την αυτοφαγία που προκαλείται από THC (Σχήμα(Σχήμα 3,3, D και E) αλλά όχι διαστολή ER (Συμπληρωματικό Σχήμα 4D) σε κύτταρα U87MG. Επιπλέον, η THC προκάλεσε αυτοφαγία σε p8 + / + αλλά όχι σε μετασχηματισμένα MEFs με ανεπάρκεια p8 (Εικόνα(Σχήμα 3F3F και συμπληρωματικό σχήμα 5C). Συνολικά, αυτά τα ευρήματα αποκαλύπτουν ότι η THC προκαλεί αυτοφαγία καρκινικών κυττάρων μέσω ενεργοποίησης μιας οδού σηματοδότησης που προκαλείται από το στρες ER που περιλαμβάνει διέγερση σύνθεσης κεραμιδίου de novo, φωσφορυλίωση eIF2α και αναπροσαρμογή ρ8 και TRB3.
Το THC αναστέλλει το Akt και το mTORC1 μέσω TRB3.
Η αναστολή του mTORC1 θεωρείται βασικό βήμα στην πρόωρη ενεργοποίηση της αυτοφαγίας ( 6 ). Επομένως, δοκιμάσαμε εάν η επαγόμενη από κανναβινοειδή αύξηση της οδού ρ8 οδηγεί σε αυτοφαγία μέσω αναστολής αυτού του συμπλόκου. Η θεραπεία με THC των κυττάρων U87MG μείωσε τη φωσφορυλίωση της p70S6 κινάσης (ένα καλά εδραιωμένο υπόστρωμα mTORC1) και της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S6 (ένα καλά εδραιωμένο υπόστρωμα κινάσης p70S6) (Εικόνα(Σχήμα 4,4, Α και C), υποδεικνύοντας ότι το mTORC1 αναστέλλεται σε κύτταρα που προκαλούνται από κανναβινοειδή. Επιπλέον, η επαγόμενη από κανναβινοειδές μείωση στην p70S6 κινάση και η φωσφορυλίωση S6, η αυτοφαγία και ο κυτταρικός θάνατος δεν ήταν εμφανείς σε κύτταρα Tsc2 – / – , στα οποία το mTORC1 είναι συστατικά ενεργό ( 20 ) (Σχήμα 4Β4Β και Συμπληρωματικό Σχήμα 6, Α και Β), υποστηρίζοντας περαιτέρω έναν σημαντικό ρόλο για την αναστολή του mTORC1 στην πρόκληση αυτοφαγικού κυτταρικού θανάτου από κανναβινοειδή.
( Α ) Επίδραση της THC στη φωσφορυλίωση p70S6K και S6 των κυττάρων U87MG ( n = 6). ( B ) Επίδραση της THC στη βιωσιμότητα των κυττάρων (αριστερό πλαίσιο; 24 ώρες; μέσος όρος ± SD; n = 6) και λιπιδίωση LC3 (δεξί πλαίσιο; 18 ώρες; n = 4) σε Tsc2 + / + και Tsc2 – / – MEF. ( C ) Επίδραση της THC σε φωσφορυλίωση Akt, TSC2, PRAS40, p70S6K και S6 κυττάρων U87MG (18 ώρες, OD σε σχέση με κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα, μέσος όρος ± SD, n = 7). ( Δ) Επίδραση της THC στη βιωσιμότητα των κυττάρων (αριστερό πλαίσιο · 24 ώρες; μέσος όρος ± SD; n = 4) και λιπιδίωση LC3 (δεξί πλαίσιο; 18 ώρες; n = 4) των pBABE και μυριστοϋλιωμένων Akt (myr-Akt) MEF. ( Ε ) Επίδραση της THC στην συν-ανοσοκαθίζηση Akt με TRB3 σε εκχυλίσματα κυττάρων U87MG (8 ώρες, OD σε σχέση με κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα, μέσος όρος ± SD, n = 9, είσοδος: TRB3). ( F και G ) Επίδραση της THC σε φωσφορυλίωση Akt, TSC2, PRAS40, p70S6K και S6 και λιπιδίωση LC3 ( μόνο G ) διαμολυσμένων με siC- και siTRB3 ( F; 18 ώρες; OD σε σχέση με κύτταρα U87MG που έχουν υποστεί επιμόλυνση με siC, μέσο όρο ± SD; n = 7; ο άνω πίνακας δείχνει μια ανάλυση των επιπέδων TRB3 mRNA) και του EGFP (Ad-EGFP) ή του αρουραίου TRB3 (Ad-TRB3) αδενοϊικού φορέα που έχει μολυνθεί ( G ; 18 h; OD σε σχέση με τα κύτταρα U87MG μολυσμένα με Ad-EGFP που έχουν υποστεί αγωγή με όχημα, μέση τιμή) ± SD; n = 4; το ανώτερο πλαίσιο δείχνει μια ανάλυση των επιπέδων rTRB3 mRNA) κυττάρων U87MG. ( Η ) Επίδραση της THC στη φωσφορυλίωση Akt, p70S6K και S6 των p8 + / + και p8 – / – MEFs ( n = 7). * Ρ <0,05 και ** P < 0,01 σε σύγκριση με MEFs Tsc2 + / + ( B ) και pBABE ( D ) που υποβλήθηκαν σε αγωγή με THC και συγκρίθηκαν με επεξεργασμένα με όχημα ( C και E ), siC-transfected ( F ) ή Ad- Κύτταρα U87MG μολυσμένα με EGFP ( G ).
Η πρωτεΐνη κινάση Akt ρυθμίζει θετικά τη δραστικότητα του συμπλόκου mTORC1 με φωσφορυλίωση και αναστολή TSC2 και PRAS40 (ένα καλά εδραιωμένο υπόστρωμα Akt εντός του συμπλέγματος mTORC1). Έτσι, η αναστολή Akt μειώνει τη δραστηριότητα mTORC1 και προάγει την αυτοφαγία ( 20 ). Σύμφωνα με αυτήν την ιδέα, η THC μείωσε τη φωσφορυλίωση των Akt, TSC2 και PRAS40 καθώς και p70S6 κινάσης και S6 (Εικόνα(Σχήμα 4C).4ΝΤΟ). Αυτή η αναστολή της οδού Akt / mTORC1 καταργήθηκε με επώαση με ανταγωνιστή υποδοχέα CB1 (Συμπληρωματικό Σχήμα 6C) ή αναστολέα σύνθεσης κεραμιδίου (Συμπληρωματικό Σχήμα 6D). Ομοίως, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν μια μυριστοϋλιωμένη (συστατικά ενεργή) μορφή Akt ήταν ανθεκτικά στην επαγόμενη από THC αναστολή mTORC1, στην αυτοφαγία και στον κυτταρικό θάνατο (Εικόνα (Σχήμα 4D4D και Συμπληρωματικό Σχήμα 6, E και F), υποστηρίζοντας περαιτέρω ότι το THC προκαλεί αυτοφαγία μέσω αναστολής Akt.
Δεδομένου ότι το TRB3 έχει αποδειχθεί ότι αλληλεπιδρά άμεσα και αναστέλλει το Akt ( 21 , 22 ), διερευνήσαμε εάν η αύξηση της ρύθμισης του TRB3 ήταν υπεύθυνη για την αναστολή του THC που προκλήθηκε από την THC Αρκετές παρατηρήσεις υποστηρίζουν ότι αυτό πράγματι συμβαίνει: (α) Η THC αύξησε την ποσότητα του Akt συν-καταβυθίστηκε με TRB3 από εκχυλίσματα U87MG (Εικόνα(Σχήμα 4Ε),4Ε), (β) νοκ άουτ του TRB3 απέτρεψε την επίδραση του THC σε Akt, TSC2, PRAS-40, p70S6 κινάση και φωσφορυλίωση S6 (Εικόνα (Σχήμα 4F),4F) και (γ) Η υπερέκφραση TRB3 μείωσε τη φωσφορυλίωση Akt, TSC2, PRAS40, p70S6 κινάσης και S6, αύξησε την ανασταλτική επίδραση της THC στη φωσφορυλίωση αυτών των πρωτεϊνών και προήγαγε την αυτοφαγία (Εικόνα (Σχήμα 4G).4ΣΟΛ). Σύμφωνα με αυτές τις παρατηρήσεις, η THC απέτυχε να αναστέλλει την Akt, p70S6 κινάση και τη φωσφορυλίωση S6 της eIF2α S51A νοκκίνης ή με ανεπάρκεια ρ8 MEF, στα οποία το TRB3 δεν ρυθμίστηκε υπερβολικά κατά τη θεραπεία με κανναβινοειδή (Εικόνα(Σχήμα 4Η4H και Συμπληρωματικό Σχήμα 6, G και H). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η υπερβολική ρύθμιση των ρ8 και TRB3 προκαλεί αυτοφαγία καρκινικών κυττάρων μέσω αναστολής της οδού Akt / mTORC1.
Η αυτοφαγία που προκαλείται από THC προάγει τον αποπτωτικό θάνατο καρκινικών κυττάρων.
Ενώ αναλύσαμε τον μηχανισμό της δράσης θανάτωσης κυττάρων κανναβινοειδών, παρατηρήσαμε ότι η επώαση με τον αναστολέα παν-κασπάσης ZVAD-fmk εμπόδισε τον κυτταρικό θάνατο στον ίδιο βαθμό με το γενετικό (Εικόνα (Σχήμα 5Α)5Α) ή φαρμακολογική (Συμπληρωματική Εικόνα 7) αναστολή της αυτοφαγίας. Επιπλέον, οι αθανατοποιημένοι MEF διπλού νοκ άουτ (DKO) Bax / Bak , οι οποίοι προστατεύονται από μιτοχονδριακή απόπτωση ( 23 ), ήταν ανθεκτικοί στον θάνατο και την απόπτωση που προκαλείται από THC (Εικόνα(Σχήμα 5Β)5Β) αλλά υπέστη φωσφορυλίωση και αυτοφαγία eIF2α (Σχήμα (Σχήμα 5C)5Γ) κατά τη θεραπεία με THC. Εξετάσαμε λοιπόν εάν η αυτοφαγία που προκαλείται από κανναβινοειδή προωθούσε τον αποπτωτικό θάνατο καρκινικών κυττάρων. Ανάλυση χρονικής πορείας της LC3 και της ενεργής ανοσοχρώσης κασπάσης-3 σε κύτταρα U87MG αποκάλυψε ότι η αυτοφαγία προηγήθηκε της εμφάνισης αποπτωτικών χαρακτηριστικών σε κύτταρα που έλαβαν THC (Εικόνα(Σχήμα 5D).5ΡΕ). Επιπλέον, επιλεκτική νοκ άουτ ATG1 (Εικόνα(Εικόνα 5D)5D) καθώς και του AMBRA1 ή του ATG5 (Συμπληρωματικό Σχήμα 8) απέτρεψαν την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 που προκαλείται από THC. Επιπλέον, σε αντίθεση με τους ομολόγους άγριου τύπου, Atg5 αθανατοποιημένοι δεν υποβλήθηκαν σε μετατόπιση φωσφατιδυλοσερίνης στο εξωτερικό φυλλάδιο της μεμβράνης πλάσματος (Εικόνα(Σχήμα 5Ε),5Ε), απώλεια δυνατοτήτων μιτοχονδριακής μεμβράνης (Εικόνα (Σχήμα 5F),5F), ή αυξημένη παραγωγή αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (Συμπληρωματικό Σχήμα 9) ως απόκριση στη θεραπεία με κανναβινοειδή. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση της οδού θανάτου κυττάρων που προκαλείται από αυτοφαγία συμβαίνει πριν από την απόπτωση στην αντικαρκινική δράση των κανναβινοειδών.
( A ) Επίδραση της THC και του αναστολέα παν-κασπάσης ZVAD (10 μM) στη βιωσιμότητα των Atg5 + / + και Atg5 – / – MEFs (36 ώρες · ποσοστό βιώσιμων κυττάρων σε σχέση με το αντίστοιχο υπό αγωγή Atg5 + / + φορέα) κύτταρα, μέσος όρος ± SD · n = 3). ( Β ) Επίδραση της THC στην απόπτωση των BEF / Bak WT και Bax / Bak DKO MEFs όπως προσδιορίζεται με κυτταροφθορομετρική ανάλυση του παραρβινίου V / ιωδιούχου προπιδίου (PI) (24 ώρες, μέσος όρος ± SD; n= 3). Το μέσο ± SD ποσοστό των θετικών στην αννεξίνη V-θετικό / PI και της θετικής στην αννεξίνη V, των αρνητικών PI εμφανίζεται στην άνω και κάτω γωνία, αντίστοιχα. ( C ) Επίδραση της THC στη φωσφορυλίωση eIF2α (3 ώρες, n = 3) και LC3 λιπιδίωση (18 ώρες, n = 4) BEF / Bak WT και DKO MEF. ( Δ) Αριστερά: Επίδραση της THC στην αυτοφαγία και απόπτωση κυττάρων U87MG επιμολυσμένα με siC ή siATG1. Πράσινες γραμμές, κελιά με κουκκίδες LC3. ερυθρές ράβδοι, ενεργά κασπάση-3-θετικά κύτταρα. λευκές ράβδους, κελιά με δύο κουκκίδες LC3 και ενεργή χρώση κασπάσης-3. Τα δεδομένα αντιστοιχούν στο ποσοστό κυττάρων με κουκκίδες LC3 (πράσινες ράβδους), ενεργά κύτταρα θετικής κασπάσης-3 (κόκκινες ράβδους) και κύτταρα με κουκκίδες LC3 και ενεργή χρώση caspse-3 (λευκές ράβδοι) σε σχέση με τον συνολικό αριθμό επιμολυσμένων κυττάρων σε κάθε χρονικό σημείο (μέσος όρος ± SD; n = 3). Δεξιά: Αντιπροσωπευτικές φωτομικρογραφίες (36 ώρες, κλίμακα ράβδου: 20 μm). ( E και ΣΤ) Επίδραση της THC στην απόπτωση ( E ; 24 h; n = 3) και απώλεια δυνατοτήτων μιτοχονδριακής μεμβράνης όπως προσδιορίζεται με χρώση DiOC 6 (3) ( F ; 24 h; n = 4) Atg5 + / + και Atg5 – / – MEF. Στο E , το μέσο ± SD ποσοστό των παραρτημάτων V-θετικών / PI-θετικών και της αννεξίνης V-θετικών, PI-αρνητικών κυττάρων εμφανίζεται στην άνω και κάτω γωνία, αντίστοιχα. ** P < 0,01 σε σύγκριση με το Atg5 + / + που έλαβε THC (A , E , και F ) και Bax / Bak WT ( B ) MEFs και από επεξεργασμένα με THC κύτταρα siC-διαμολυσμένα ( D ).
Η ενεργοποίηση της αυτοφαγίας είναι απαραίτητη για την αντικαρκινική δράση κανναβινοειδών in vivo.
Για να προσδιορίσουμε τη in vivo συνάφεια των ευρημάτων μας, διερευνήσαμε πρώτα εάν το THC προάγει την ενεργοποίηση της παραπάνω περιγραφόμενης μεσολαβούμενης από αυτοφαγική οδού θανάτου κυττάρων σε ξενομοσχεύματα όγκου που προέρχονται από κύτταρα U87MG, στα οποία έχουμε πρόσφατα δείξει ότι η θεραπεία με κανναβινοειδή μειώνει την ανάπτυξη όγκου ( Συγκεκριμένα, η χορήγηση THC για 14 ημέρες μείωσε την ανάπτυξη του όγκου κατά 50% · αναφορά 13 ). Η ανάλυση αυτών των όγκων αποκάλυψε ότι η χορήγηση κανναβινοειδών αυξάνει την έκφραση TRB3 και μειώνει τη φωσφορυλίωση S6 (Σχήμα(Σχήμα 6Α).6ΕΝΑ). Ομοίως, παρατηρήθηκε σχηματισμός κουκκίδων LC3 καθώς και αύξηση της ανοσοχρώσης LC3-II και ενεργής κασπάσης-3 σε όγκους που υποβλήθηκαν σε αγωγή με THC, αλλά όχι σε όχημα (Εικόνα(Σχήμα 6Β).6ΣΙ).
( Α ) Επίδραση της περιτοναϊκής χορήγησης THC στην ανοσοχρώση TRB3 και p-S6 σε όγκους U87MG. TRB3- ή p-S6-χρωματισμένη περιοχή ομαλοποιημένη με τον συνολικό αριθμό πυρήνων σε κάθε ενότητα. Οι αριθμοί δείχνουν τη μέση μεταβολή πτυχών ± SD; Μετρήθηκαν 18 τομές για καθένα από τους 3 τεμαχισμένους όγκους για κάθε πάθηση. Ράβδος κλίμακας: 50 μm. ( Β) Αριστερά: Επίδραση της περιτοναϊκής χορήγησης THC σε LC3 και ενεργή ανοσοχρώση κασπάσης-3 σε όγκους U87MG. Τα βέλη δείχνουν σε κελιά με κουκκίδες LC3. Οι αριθμοί υποδεικνύουν το ποσοστό ενεργών κυπασών-3-θετικών κυττάρων σε σχέση με τον συνολικό αριθμό πυρήνων σε κάθε ενότητα ± SD. Μετρήθηκαν δέκα τομές για καθένα από τους 3 τεμαχισμένους όγκους για κάθε πάθηση. Ράβδοι κλίμακας: 20 μm. Δεξιά: Επίδραση της περιτοναϊκής χορήγησης THC στην λιπιδίωση LC3 σε όγκους U87MG. Δείχνονται αντιπροσωπευτικά δείγματα από 1 όγκο που υποβλήθηκε σε αγωγή και 1 THC. Οι αριθμοί υποδεικνύουν τις τιμές LC3-I και LC3-II OD σε σχέση με όγκους που υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα (μέσος όρος ± SD). n = 3. ( Γ) Αριστερά: Επίδραση της χορήγησης THC στην ανοσοχρώση LC3 (πράσινο) και TUNEL (κόκκινο) στα ξενομοσχεύματα όγκου Ras V12 / E1A p8 + / + και p8 – / – . Τα βέλη δείχνουν σε κελιά με κουκκίδες LC3 και θετικούς πυρήνες TUNEL. Δεξιά: Το γράφημα ράβδων δείχνει το ποσοστό θετικών πυρήνων TUNEL ή κυττάρων με θετικούς πυρήνες TUNEL και κουκκίδες LC3 σε σχέση με τον συνολικό αριθμό πυρήνων σε κάθε ενότητα (μέσος όρος ± SD). Δεκαοκτώ τομές μετρήθηκαν από 3 τεμαχισμένους όγκους για κάθε πάθηση. Ράβδοι κλίμακας: 50 μm. Το ένθετο δείχνει τη μεγέθυνση 1 επιλεγμένου κελιού (τα βέλη δείχνουν τις κουκκίδες LC3, γραμμή κλίμακας: 10 μm). *P < 0,05 και ** P < 0,01 σε σύγκριση με όγκους που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα.
Για να διερευνήσουμε περαιτέρω εάν η ενεργοποίηση της οδού p8 μεσολαβεί σε αντικαρκινική δράση κανναβινοειδών, αναλύσαμε επίσης όγκους που προέρχονται από μετασχηματισμένα με ρ8 + / + και ρ8 – / – Ras V12 / E1A (σε αυτήν την περίπτωση, η χορήγηση THC για 8 ημέρες μειώθηκε κατά 45% την ανάπτυξη όγκων p8 + / +, αλλά δεν είχε σημαντική επίδραση στους όγκους p8 – / – · αναφ. 13 ). Η θεραπεία με THC αύξησε την έκφραση TRB3, μείωσε τη φωσφορυλίωση S6 και αύξησε την αυτοφαγία, καθώς και την ανοσοχρώση TUNEL και ενεργής κασπάσης-3 σε p8 + / +αλλά όχι όγκοι p8 – / – (Σχήμα(Σχήμα 6C6C και συμπληρωματικό σχήμα 10). Επιπλέον, η θεραπεία με THC ενίσχυσε τον αριθμό των κυττάρων με κουκκίδες LC3 και θετικούς πυρήνες TUNEL σε p8 + / + αλλά όχι σε όγκους p8 – / – (Εικόνα(Σχήμα 6C).6ΝΤΟ).
Προκειμένου να επαληθευτεί η σημασία της αυτοφαγίας για την αντικαρκινική δράση των κανναβινοειδών, στη συνέχεια δημιουργήσαμε όγκους με μετασχηματισμένους με αντιγόνο Atg5 + / + και Atg5 – / – Ras V12 / T-MEF. Η χορήγηση THC μείωσε κατά περισσότερο από 80% την ανάπτυξη όγκων που προέρχονταν από κύτταρα άγριου τύπου, αλλά δεν είχε σημαντική επίδραση σε αυτούς τους όγκους που δημιουργήθηκαν από κύτταρα με έλλειψη αυτοφαγίας (Εικόνα (Σχήμα 7Α).7ΕΝΑ). Επιπλέον, η χορήγηση κανναβινοειδών αύξησε την αυτοφαγία, TUNEL (Σχήμα(Σχήμα 7Β),7Β), και ενεργή ανοσοχρώση κασπάσης-3 (Συμπληρωματικό Σχήμα 11) σε Atg5 + / + αλλά όχι Atg5 – / – όγκους. Ομοίως, η χορήγηση κανναβινοειδών αύξησε τον αριθμό των κυττάρων με κουκκίδες LC3 και θετικούς πυρήνες TUNEL σε Atg5 + / + αλλά όχι Atg5 – / – όγκους (Εικόνα (Σχήμα 7Β).7ΣΙ). Συνολικά, αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση της οδού θανάτου κυττάρων που προκαλείται από αυτοφαγία είναι απαραίτητη για την αντικαρκινική δράση των κανναβινοειδών.
( Α ) Επίδραση της περιτοναϊκής χορήγησης THC στην ανάπτυξη Atg5 + / + (άνω πάνελ) και Atg5 – / – (κάτω πλαίσιο) Ξενομοσχεύματα όγκου Ras V12 / T-μεγάλου αντιγόνου MEF που δημιουργούνται σε γυμνούς ποντικούς (μέσος όρος ± SD; n = 7 για κάθε κατάσταση). Οι φωτογραφίες δείχνουν αντιπροσωπευτικές εικόνες όγκων και THC που έχουν υποστεί αγωγή. ( B ) Αριστερά: Επίδραση της χορήγησης THC στην ανοσοχρώση LC3 (πράσινη) και απόπτωση όπως προσδιορίζεται από το TUNEL (κόκκινο) σε Atg5 + / + και Atg5 – / –Ξενομοσχεύματα όγκου MEF. Εμφανίζονται αντιπροσωπευτικές εικόνες από 1 όγκους που έχουν υποστεί αγωγή με όχημα και 1 όγκους Atg5 + / + και Atg5 – / – που έχουν υποστεί αγωγή με THC . Δεξιά: Τα γραφήματα ράβδων δείχνουν το ποσοστό θετικών πυρήνων TUNEL και κυττάρων με θετικούς πυρήνες TUNEL και κουκκίδες LC3 σε σχέση με τον συνολικό αριθμό πυρήνων σε κάθε ενότητα (μέσος όρος ± SD). Δεκαοκτώ τομές μετρήθηκαν από 3 τεμαχισμένους όγκους για κάθε πάθηση (θεραπεία με όχημα και θεραπεία με THC). Ράβδος κλίμακας: 50 μm. ( Γ ) Σχηματικό του προτεινόμενου μηχανισμού κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από THC (βλ. Κείμενο για λεπτομέρειες). ** Ρ < 0,01 σε σύγκριση με όγκους που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα.
Τέλος, αναλύσαμε τους όγκους 2 ασθενών που συμμετείχαν σε κλινική δοκιμή με στόχο τη διερεύνηση της επίδρασης της THC στο υποτροπιάζον πολύμορφο γλοιοβλάστωμα. Οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε ενδοκρανιακή χορήγηση THC και λήφθηκαν βιοψίες πριν και μετά τη θεραπεία ( 11 ). Στους 2 ασθενείς, ο εμβολιασμός κανναβινοειδών αύξησε την ανοσοχρώση TRB3 και μείωσε τη φωσφορυλίωση S6 (Σχήμα(Σχήμα 8Α).8ΕΝΑ). Είναι ενδιαφέρον ότι ο αριθμός των κυττάρων με αυτοφαγικό φαινότυπο (Σχήμα(Σχήμα8Β)8Β) καθώς και με ενεργή ανοσοχρώση κασπάσης-3 (Εικόνα (Σχήμα 8C)8C) αυξήθηκε στα δείγματα όγκων που ελήφθησαν μετά από θεραπεία THC. Αν και αυτές οι μελέτες διεξήχθησαν μόνο σε δείγματα από 2 ασθενείς, είναι σύμφωνες με τα προκλινικά στοιχεία που φαίνονται παραπάνω και υποδηλώνουν ότι η χορήγηση κανναβινοειδών μπορεί επίσης να προκαλέσει κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από αυτοφαγία σε ανθρώπινους όγκους.
Ανάλυση διαφορετικών παραμέτρων σε 2 ασθενείς με πολύμορφο γλοιοβλάστωμα πριν και μετά την ενδοκρανιακή θεραπεία με THC (εκτιμήθηκε ότι οι δόσεις των 6-10 μM επιτεύχθηκαν στο σημείο χορήγησης). ( Α ) ανοσοχρώση TRB3 και p-S6. Εμφανίζονται αντιπροσωπευτικές φωτομικρογραφίες. Οι αριθμοί υποδεικνύουν την περιοχή που βάφεται με TRB3 ή p-S6 ομαλοποιημένη στον συνολικό αριθμό πυρήνων σε κάθε ενότητα (μέση μεταβολή πτυχών ± SD) σε σχέση με το αντίστοιχο δείγμα προ-θεραπείας. Μετρήθηκαν δεκαπέντε τομές για κάθε όγκο και κάθε κατάσταση (πριν και μετά τη θεραπεία). Ράβδος κλίμακας: 50 μm. ( Β) Αντιπροσωπευτικές φωτομικρογραφίες της ανοσοχρώσης διαμινοβενζιδίνης LC3. Το μέσο ποσοστό κυττάρων με κουκκίδες LC3 ± SD σε σχέση με τον συνολικό αριθμό πυρήνων σε κάθε ενότητα σημειώνεται στη γωνία κάθε πίνακα. Μετρήθηκαν δέκα τομές από κάθε βιοψία για κάθε πάθηση. Τα βέλη δείχνουν σε κελιά με κουκκίδες LC3. Ράβδος κλίμακας: 20 μm. ( Γ) Αντιπροσωπευτικές φωτομικρογραφίες της ενεργής ανοσοχρώσης διαμινοβενζιδίνης δραστικής κασπάσης-3. Οι αριθμοί υποδεικνύουν το ποσοστό των κυττάρων με ενεργή χρώση κασπάσης-3 ± SD σε σχέση με τον συνολικό αριθμό πυρήνων σε κάθε ενότητα. Μετρήθηκαν δέκα τομές από κάθε βιοψία για κάθε πάθηση. Τα βέλη δείχνουν σε κύτταρα με ενεργή χρώση κασπάσης-3. Ράβδος κλίμακας: 20 μm. * P < 0,05 και ** P < 0,01 σε σύγκριση με πριν από τη θεραπεία.
Συζήτηση
Σε αυτή τη μελέτη δείχνουμε ότι τα κανναβινοειδή, μια νέα οικογένεια πιθανών αντικαρκινικών παραγόντων, προκαλούν αυτοφαγία καρκινικών κυττάρων και ότι αυτή η διαδικασία μεσολαβεί στην κυτταρική θανάτωση που προάγει τη δράση αυτών των ενώσεων. Αρκετές παρατηρήσεις υποστηρίζουν σθεναρά αυτήν την ιδέα: (α) Η THC προκάλεσε αυτοφαγία και κυτταρικό θάνατο σε διαφορετικούς τύπους καρκινικών κυττάρων αλλά όχι σε μη μετασχηματισμένα αστροκύτταρα, τα οποία είναι ανθεκτικά στη δράση θανάτωσης κανναβινοειδών, (β) η φαρμακολογική ή γενετική αναστολή της αυτοφαγίας απέτρεψε τα κύτταρα που προκαλούνται από THC θάνατος, (γ) όγκοι με έλλειψη αυτοφαγίας ήταν ανθεκτικοί στη δράση που αναστέλλει την ανάπτυξη THC και (δ) η χορήγηση THC ενεργοποίησε την οδό θανάτου αυτοφαγικών κυττάρων σε 3 διαφορετικά μοντέλα ξενομοσχευμάτων όγκου καθώς και σε 2 δείγματα ανθρώπινων όγκων.
Ανάλογα με το κυτταρικό πλαίσιο και τη δύναμη και τη διάρκεια του ερεθίσματος που προκαλεί, η αυτοφαγία εμπλέκεται στην προαγωγή ή την αναστολή της επιβίωσης των καρκινικών κυττάρων ( 4 , 5 , 24 , 25). Ωστόσο, οι μοριακές βάσεις αυτού του διπλού ρόλου της αυτοφαγίας στον καρκίνο παραμένουν άγνωστες. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ δείχνουν ότι η πρόκληση αυτοφαγίας από κανναβινοειδή οδηγεί σε θάνατο καρκινικών κυττάρων και προσδιορίζει την οδό σηματοδότησης που είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση αυτής της κυτταρικής διαδικασίας. Έτσι, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι το THC – μέσω της ενεργοποίησης του υποδοχέα CB1 και της διέγερσης της σύνθεσης κεραμιδίου de novo – ενεργοποιεί μια πρώιμη απόκριση στο στρες ER που οδηγεί σε αυξημένη φωσφορυλίωση του eIF2α στο Ser51. Πειράματα που πραγματοποιήθηκαν με μεταλλαγμένα κύτταρα eIF2α S51A έχουν δείξει ότι η φωσφορυλίωση αυτού του υπολείμματος, η οποία είναι γνωστό ότι εξασθενεί τη γενική μετάφραση πρωτεϊνών, ενώ ενισχύει την έκφραση αρκετών γονιδίων που σχετίζονται με την απόκριση στο στρες ER (17 ), απαιτείται για την υπερβολική ρύθμιση της πρωτεΐνης στρες p8 και των ER που σχετίζεται με το άγχος κατάντη στόχων ATF4, CHOP και TRB3, καθώς και για την πρόκληση αυτοφαγίας από κανναβινοειδή. Επιπλέον, αποδεικνύουμε ότι η αύξηση της ρύθμισης των p8 και TRB3, η οποία είχε προηγουμένως εμπλακεί στον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από κανναβινοειδή ( 13 ), είναι ένα κρίσιμο γεγονός για την ενεργοποίηση της αυτοφαγίας. Έχει προταθεί συσσώρευση κεραμίδης για την πρόκληση στρες ER ( 26 , 27 ) και αυτοφαγίας ( 28 ) και η φωσφορυλίωση eIF2α έχει εμπλακεί στην πρόκληση αυτοφαγίας σε απόκριση σε διαφορετικές καταστάσεις ( 29 – 31). Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για αυτές τις δράσεις δεν έχουν διευκρινιστεί. Τα ευρήματα που παρουσιάζονται εδώ υποδηλώνουν ότι η αναπροσαρμογή της οδού p8-TRB3 αποτελεί έναν μηχανισμό με τον οποίο η de novo-συνθετική κεραμίδη και η φωσφορυλίωση eIF2α προάγουν την αυτοφαγία, αναγνωρίζοντας έτσι αυτό που πιστεύουμε ότι είναι μια νέα σύνδεση μεταξύ του στρες ER και της αυτοφαγίας.
Τα δεδομένα μας δείχνουν επίσης ότι η δραστηριότητα που προάγει την αυτοφαγία της ρυθμισμένης οδού p8 βασίζεται στην ικανότητά της να αναστέλλει τον άξονα Akt / mTORC1. Η ρύθμιση του mTORC1 βασίζεται σε μεγάλο βαθμό στη δραστηριότητα της prosurvival kinase Akt, της οποίας η αναστολή οδηγεί σε απενεργοποίηση του mTORC1 και, με τη σειρά του, στην αυτοφαγία ( 20 ). Τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν ότι το THC ρυθμίζει το TRB3, προωθώντας την αλληλεπίδρασή του με το Akt και οδηγώντας σε μειωμένη φωσφορυλίωση αυτής της κινάσης καθώς και των άμεσων υποστρωμάτων του TSC2 και PRAS40, τα οποία ενεργοποιούν την αναστολή του mTORC1 και την επαγωγή της αυτοφαγίας. Το TRB3 έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι αναστέλλει το Akt ( 21 , 22, αν και η ακριβής συμβολή αυτής της ψευδο-κινάσης στη ρύθμιση της δραστηριότητας Akt σε διαφορετικά κυτταρικά περιβάλλοντα είναι ασαφής ( 32). Εδώ αποδεικνύουμε ότι η αναστολή TRB3 του άξονα Akt / mTORC1 είναι απαραίτητη για αυτοφαγία καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από κανναβινοειδή. Επιπλέον, δείχνουμε ότι αυτή η πορεία είναι απαραίτητη για την αντικαρκινική δράση των κανναβινοειδών. Έτσι, η χορήγηση THC οδηγεί σε αύξηση του TRB3, στην αναστολή του mTORC1, στην πρόκληση αυτοφαγίας και στη μείωση της ανάπτυξης του όγκου σε διαφορετικά μοντέλα ξενομοσχευμάτων όγκου, αλλά όχι σε όγκους με ανεπάρκεια p8 που είναι ελαττωματικοί στην άνω ρύθμιση της οδού p8 / TRB3. Επιπλέον, η ενεργοποίηση αυτής της οδού ήταν επίσης εμφανής σε 2 ασθενείς με γλοίωμα που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με THC. Αυτά τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν έτσι έναν ρόλο για το TRB3 που μπορεί να έχει μεγάλη σημασία στη ρύθμιση του θανάτου από καρκινικά κύτταρα.
Η αυτοφαγία έχει προταθεί για προστασία από απόπτωση, ενεργεί ως εναλλακτική οδός απόπτωσης για την πρόκληση κυτταρικού θανάτου ή ενεργεί μαζί με απόπτωση ως συνδυασμένος μηχανισμός κυτταρικού θανάτου ( 6 , 33). Ωστόσο, πολύ λίγα είναι γνωστά για το ρόλο της αλληλεπίδρασης μεταξύ αυτών των 2 κυτταρικών διεργασιών στον έλεγχο της ανάπτυξης όγκου σε απόκριση σε αντικαρκινικούς παράγοντες. Τα αποτελέσματά μας τώρα δείχνουν ξεκάθαρα ότι η επαγωγή της αυτοφαγίας εμπλέκεται στον μηχανισμό με τον οποίο τα κανναβινοειδή προάγουν την ενεργοποίηση της μιτοχονδριακής προ-αποπτωτικής οδού. Έτσι, ούτε οι όγκοι στους οποίους η οδός που ρυθμίζεται με ρ8 έχει αφαιρεθεί (και κατά συνέπεια, η θεραπεία με THC δεν προκαλεί αυτοφαγία) ούτε οι όγκοι εγγενώς ανεπαρκείς στην αυτοφαγία υποβάλλονται σε απόπτωση σε απόκριση στην THC, και έτσι είναι ανθεκτικοί στην THC κατά του όγκου δράση . Αυτά τα ευρήματα αποκαλύπτουν ότι απαιτείται αυτοφαγία για την ενεργοποίηση της απόπτωσης σε απόκριση στη θεραπεία με κανναβινοειδή in vivo.
Αξίζει να σημειωθεί ότι οι συγκεντρώσεις THC που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη βρίσκονται στο ίδιο εύρος με αυτές που χορηγούνται ενδοκρανιακά στους ασθενείς στους οποίους παρατηρήσαμε ενεργοποίηση της οδού θανάτου κυττάρων που προκαλείται από αυτοφαγία ( 11 ) και επομένως θα μπορούσαν να θεωρηθούν κλινικά σημαντικές. Ενδιαφέρον, η ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση THC σε ξενομοσχεύματα όγκου U87MG προκαλεί παρόμοια μείωση στην ανάπτυξη όγκου (που συμβαίνει σε συνδυασμό με αυξημένη αυτοφαγία και απόπτωση) με εκείνη που παρατηρείται όταν το κανναβινοειδές χορηγείται περιτοναϊκά (οι μη δημοσιευμένες παρατηρήσεις μας). Λαμβάνοντας υπόψη ότι δεν παρατηρήθηκαν σημεία τοξικότητας στους ασθενείς της κλινικής δοκιμής ( 11) ή σε ζώα που φέρουν όγκο που υποβάλλονται σε θεραπεία ενδοκρανιακά, περιφερικά ή ενδοπεριτοναϊκά με THC (παραπομπές 34 και 35 και δεν εμφανίζονται δεδομένα) και ότι δεν έχουν αναφερθεί εμφανείς τοξικές επιδράσεις σε άλλες κλινικές δοκιμές χρήσης κανναβινοειδών σε καρκινοπαθείς για διάφορες εφαρμογές (π.χ. αναστολή της ναυτίας, του εμέτου και του πόνου) και χρήση διαφορετικών οδών χορήγησης (π.χ. στοματική ή στοματική βλεννογόνο) ( 9 , 36 ), τα ευρήματά μας υποστηρίζουν ότι ασφαλείς, θεραπευτικά αποτελεσματικές δόσεις THC μπορεί να επιτευχθούν σε καρκινοπαθείς .
Συνοπτικά, σε αυτή τη μελέτη εντοπίζουμε αυτό που πιστεύουμε ότι είναι μια νέα οδός που συνδέει την απόκριση στρες ER με την ενεργοποίηση της αυτοφαγίας και προωθεί τον αποπτωτικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων (Εικόνα (Σχήμα 7C).7ΝΤΟ). Η αναγνώριση αυτής της οδού θα βοηθήσει στην κατανόηση των μοριακών συμβάντων που οδηγούν στην ενεργοποίηση του μεσολαβούμενου από αυτοφάγο κυτταρικού θανάτου από αντικαρκινικά φάρμακα και μπορεί να συμβάλει στο σχεδιασμό νέων θεραπευτικών στρατηγικών για την αναστολή της ανάπτυξης όγκων.
Μέθοδοι
Κυτταρική καλλιέργεια και βιωσιμότητα.
Φλοιώδη αστροκύτταρα παρασκευάστηκαν από ποντίκια ηλικίας 24 ωρών όπως περιγράφηκε προηγουμένως ( 13 ). Παρασκευάστηκαν πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων όγκου εγκεφάλου και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται στις Συμπληρωματικές Μέθοδοι. Κύτταρα U87MG, T98G, U373MG και MiaPaCa2, M8s P8 + / + και p8 – / – Ras V12 / E1A, Atg5 + / + και Atg5 – / – T-large (παρέχονται από το Noboru Mizushima, Ιατρικό και Οδοντιατρικό Πανεπιστήμιο του Τόκιο , Τόκιο, Ιαπωνία), Bax / Bak φυσικού τύπου και Bax / BakDKO T-large αντιγόνο MEFs (παρέχονται από Luca Scorrano, Dulbecco Telethon Institute, Milan, Italy and Patrizia Agostinis, Catholic University of Leuven, Leuven, Belgium), eIF2α S51S WT και eIF2α S51A T-large antigen MEFs (παρέχονται από τον Richard Kaufman , University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, USA και Cesar de Haro and Juan J. Berlanga, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Autonoma University, Madrid, Spain), Tsc2 + / + και Tsc2 – / – p53 – / – MEF, κενό διάνυσμα (pBABE) και pBABE-myr-Akt MEF, και Atg5 + / + και Atg5 – / – Τα MEFs αντιγόνου Ras V12 / T καλλιεργήθηκαν σε DMEM που περιείχε 10% FBS και μεταφέρθηκαν σε μέσο που περιείχε 0,5% FBS (εκτός από MEFs μετασχηματισμένα με Ras V12 / E1A, τα οποία μεταφέρθηκαν σε μέσο που περιείχε 2% FBS) 18 ώρες πριν από την εκτέλεση των διαφορετικών θεραπείες. p8 + / + και p8 – / – Ras V12 / E1A MEF καθώς και Atg5 + / + και Atg5 – / – Ras V12/ Τα μεγάλα αντιγόνα MEF αντιστοιχούν σε ένα πολυκλωνικό μείγμα τουλάχιστον 20 διαφορετικών επιλεγμένων κλώνων. Εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά, το THC χρησιμοποιήθηκε σε τελική συγκέντρωση 5 μM. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζολίου βρωμίου] (Sigma-Aldrich).
Κυτταρομετρία ροής.
Εν συντομία, τα κύτταρα (περίπου 5 × 10 5 κύτταρα ανά δοκιμασία) τρυψινοποιήθηκαν, χωρίζεται σε 2 σωλήνες, πλύθηκε, και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 1.500 g για 5 λεπτά. Ένα κλάσμα επωάστηκε για 10 λεπτά στους 37 ° C με Annexin V – FITC (BD Biosciences). Προστέθηκε ιωδιούχο προπίδιο (1 μg / ml) λίγο πριν από την ανάλυση της κυτταροφθορομετρικής. Το άλλο κλάσμα επισημάνθηκε ταυτόχρονα με ιωδιούχο 3,3ι-διεξυλοξακαρβοκυανίνη (DiOC 6[3], 40 ηΜ; Invitrogen) και hydroethidium (5 μM; Invitrogen) για 10 λεπτά στους 37 ° C, ακολουθούμενη από κυτταροφθορομετρική ανάλυση Τα κύτταρα (10.000) καταγράφηκαν σε κάθε ανάλυση. Η ένταση φθορισμού αναλύθηκε σε κυτταρόμετρο ροής EPICS XL (Beckman Coulter).
Δυτική κηλίδα.
Η ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε ακολουθώντας τυπικές διαδικασίες. Ένας κατάλογος των αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται μπορεί να βρεθεί στις Συμπληρωματικές Μέθοδοι. Η πυκνομετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με λογισμικό Quantity One (Bio-Rad).
Διαμολύνσεις.
Κύτταρα U87MG (75% συρροή) επιμολύνθηκαν με διπλά siRNA χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο DharmaFECT 1 Transfection (Dharmacon). Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και σπάρθηκαν 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση, σε πυκνότητα 5.000 κύτταρα / cm 2 . Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης ήταν μεγαλύτερη από 70% όπως παρακολουθήθηκε με ένα φθορίζον (κόκκινο) siRNA μάρτυρα (siGLO RISC-ελεύθερο siRNA, Dharmacon). Σε πειράματα ανοσοφθορισμού, μάρτυρες και εκλεκτικά siRNAs χρησιμοποιήθηκαν σε αναλογία 1: 5 και τα κύτταρα με κόκκινες κηλίδες βαθμολογήθηκαν ως επιμολυσμένα.
Λοιμώξεις με αδενοϊικούς φορείς.
Κύτταρα U87MG (75% συρροή) μεταφέρθηκαν για 1 ώρα με υπερκείμενα που ελήφθησαν από κύτταρα ΗΕΚ293 μολυσμένα με αδενοϊικούς φορείς που φέρουν EGFP (παρέχεται από τον Javier G. Castro, Hospital Infantil Universitario Niño Jesús, Μαδρίτη, Ισπανία), TRB3 με σήμανση HA αρουραίου (δωρεά από τον Patrick Iynedjian, Πανεπιστήμιο της Γενεύης, Γενεύη, Ελβετία) ( 32 ) ή ανθρώπινο EGFP-LC3 (παρέχεται από τους Aviva Tolkovsky και Christoph Goemans, University of Cambridge, Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο). Η αποτελεσματικότητα της μόλυνσης ήταν μεγαλύτερη από 80% όπως προσδιορίστηκε από τον φθορισμό EGFP.
Παρεμβολή RNA.
Διπλόκλωνα διπλά RNA αγοράστηκαν από τη Dharmacon. Μπορείτε να βρείτε μια λίστα ακολουθιών στις Συμπληρωματικές Μέθοδοι.
Ανάλυση RT-PCR.
Το RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Trizol (Invitrogen). Το cDNA ελήφθη με Transcriptor Reverse transcriptase (Roche Applied Science). Οι εναρκτήρες και οι συνθήκες ενίσχυσης μπορούν να βρεθούν στις Συμπληρωματικές Μέθοδοι.
Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο.
Το cDNA ελήφθη χρησιμοποιώντας Transcriptor (Roche Applied Science). Πραγματοποιήθηκαν ποσοτικοί προσδιορισμοί PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας το FastStart Universal Probe Master mix με Rox (Roche Applied Science) και ελήφθησαν ανιχνευτές από το Universal ProbeLibrary Set (Roche Applied Science). Οι αλληλουχίες εκκινητών μπορούν να βρεθούν στις συμπληρωματικές μεθόδους. Οι ενισχύσεις εκτελέστηκαν σε 7900 HT-Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Κάθε τιμή προσαρμόστηκε χρησιμοποιώντας τα επίπεδα RNA 18S ως αναφορά.
Ανοσοκαθίζηση.
Κύτταρα U87MG λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης HEPES (βλέπε Συμπληρωματικές Μέθοδοι για σύνθεση ρυθμιστικού). Το προϊόν λύσης (1-4 mg) προετοιμάστηκε με επώαση με 5-20 μl πρωτεΐνης G – Sepharose συζευγμένη με προ-άνοσο IgG. Τα εκχυλίσματα λύσης στη συνέχεια επωάστηκαν με 5-20 μl πρωτεΐνης G – Sepharose συζευγμένα με 5-20 μg του αντι-TRB3 αντισώματος ή προ-ανοσοποιητικού IgG. Το TRB3 αντίσωμα (αμινοτερματικό άκρο, ab50516, Abcam) συζεύχθηκε ομοιοπολικά με πρωτεΐνη G-Sepharose χρησιμοποιώντας διμεθυλοπιμελιμιδικό. Πραγματοποιήθηκαν ανοσοκαταβυθίσεις για 1 ώρα στους 4 ° C σε περιστροφικό τροχό. Τα ανοσοκαταβυθίσματα πλύθηκαν 4 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης HEPES, ακολουθούμενο από 2 πλύσεις με ρυθμιστικό διάλυμα HEPES κινάσης.Τα ανοσοκαταβυθισμένα διαλύματα επαναιωρήθηκαν σε 30 μl ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος (που δεν περιείχε 2-μερκαπτοαιθανόλη) και διηθήθηκαν μέσω φίλτρου Spin-X 0,22 μm και προστέθηκε 2-μερκαπτοαιθανόλη σε συγκέντρωση 1% (vol / vol). Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση και ανάλυση ανοσοκηλίδας.
Επίπεδα κεραμιδίου.
Τα επίπεδα κεραμιδίου προσδιορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως ( 37 ).
Μικροσκοπική σάρωση λέιζερ Confocal.
Χρησιμοποιήθηκαν τυπικά πρωτόκολλα για μικροσκοπία ανοσοφθορισμού (βλέπε Συμπληρωματικές μεθόδους για τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν). Για να ποσοτικοποιηθεί το ποσοστό κυττάρων με κουκκίδες LC3 ή PDI, μετρήθηκαν τουλάχιστον 200 κύτταρα ανά συνθήκη σε τυχαία επιλεγμένα πεδία. Σε όλες τις περιπτώσεις, μόνο εκείνα τα κύτταρα με 4 ή περισσότερες εμφανείς κουκίδες είτε LC3 είτε PDI βαθμολογήθηκαν θετικά.
In vivo θεραπείες.
Οι όγκοι που προέρχονται από κύτταρα U87MG και p8 + / + και p8 – / – MEF προκλήθηκαν και υποβλήθηκαν σε αγωγή όπως περιγράφηκε προηγουμένως ( 13 ). Όγκοι που προέρχονται από Atg5 + / + ή Atg5 – / – Ras V12 / T-μεγάλο αντιγόνο MEFs (βλέπε Συμπληρωματικές Μέθοδοι για τη διαδικασία που χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία αυτών των κυττάρων) προκλήθηκαν σε γυμνούς ποντικούς με υποδόρια ένεση 10 7 κυττάρων σε PBS συμπληρωμένο με 0,1 % γλυκόζη. Οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν έως ότου ένας μέσος όγκος 200-250 mm 3, και τα ζώα ανατέθηκαν τυχαία στις διάφορες ομάδες. Σε αυτό το σημείο, το όχημα ή THC (15 mg / kg / d) σε 100 μl PBS συμπληρωμένο με 5 mg / ml BSA χορηγήθηκε ημερησίως σε μία ενετική ένεση. Οι όγκοι μετρήθηκαν με ένα εξωτερικό πάχος και ο όγκος υπολογίστηκε ως (4π / 3) × (πλάτος / 2) 2 × (μήκος / 2). Όλες οι διαδικασίες που αφορούσαν ζώα πραγματοποιήθηκαν με την έγκριση της επιτροπής πειράματος ζώων του Πανεπιστημίου Complutense σύμφωνα με τους ισπανικούς επίσημους κανονισμούς.
Δείγματα ανθρώπινων όγκων.
Βιοψίες όγκου ελήφθησαν από 2 υποτροπιάζοντες πολλαπλούς ασθενείς με γλοιοβλάστωμα που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με THC. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών και η κλινική μελέτη έχουν περιγραφεί λεπτομερώς αλλού ( 11 ). Εν συντομία, THC διαλυμένο σε 30 ml φυσιολογικού ορού διαλύματος συν 0,5% (κ.β.) αλβουμίνης ανθρώπινου ορού χορηγήθηκε ενδοογκικά στους ασθενείς. Ο ασθενής 1 έλαβε συνολικά 1,46 mg THC για 30 ημέρες, ενώ ο ασθενής 2 έλαβε συνολικά 1,29 mg THC για 26 ημέρες (εκτιμήθηκε ότι οι δόσεις των 6-10 μM THC επιτεύχθηκαν στη θέση χορήγησης · αναφ. 11 ). Τα δείγματα στερεώθηκαν σε φορμαλίνη, ενσωματώθηκαν σε παραφίνη και χρησιμοποιήθηκαν για ανοσομικροσκόπηση.
Ανοσο μικροσκοπία δειγμάτων όγκου.
Δείγματα από ξενομοσχεύματα όγκου τεμαχίστηκαν, το Tissue-Tek (Sakura) ενσωματώθηκε, καταψύχθηκε και, πριν πραγματοποιηθούν οι διαδικασίες χρώσης, σταθεροποιήθηκαν σε ακετόνη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Δείγματα από ανθρώπινους όγκους υποβλήθηκαν σε αποπαραφινίωση, επανυδάτωση και ανάκτηση αντιγόνου πριν από την εκτέλεση των διαδικασιών χρώσης. Χρησιμοποιήθηκαν τυπικά πρωτόκολλα για μικροσκοπία ανοσοφθορισμού ή ανοσοϊστοχημείας (βλ. Συμπληρωματικές Μέθοδοι). Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με ιωδιούχο ΤΟΤΟ-3 (δείγματα U87MG και ανθρώπινου όγκου, Invitrogen) ή Hoechst 33342 (όγκοι MEF, Invitrogen). Οι εικόνες φθορισμού αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Metamorph-Offline 6.2 (Universal Imaging) και το μικροσκόπιο Zeiss Axioplan 2.
ΤΟΥΝΑΛ.
Τα δείγματα όγκου σταθεροποιήθηκαν, μπλοκαρίστηκαν και διαπερατοποιήθηκαν και το TUNEL πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως ( 13 )
Ηλεκτρονική μικροσκόπηση.
Η υπερδομική ανάλυση κυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα και THC αξιολογήθηκε με συμβατική ενσωμάτωση στην εποξυ-ρητίνη EML-812 (Taab Laboratories). Οι τομές Ultrathin (πάχους 20 έως 30 nm) των δειγμάτων ελήφθησαν με τη χρήση ενός υπερμικροτόμου Leica-Reichert-Jung και μετά χρωματίστηκαν με κορεσμένο οξικό ουρανύλιο-κιτρικό μόλυβδο με πρότυπες διαδικασίες. Οι τομές Ultrathin αναλύθηκαν σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης JEOL 1200-EX II που λειτουργεί στα 100 kV.
Στατιστική.
Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε από την ANOVA με μετα-hoc ανάλυση χρησιμοποιώντας το τεστ Student-Neuman-Keuls. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν η τιμή Ρ ήταν μικρότερη από 0,05.
Ευχαριστίες
Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το ισπανικό Υπουργείο Παιδείας και Επιστημών (MEC) (HF2005 / 0021, στον G. Velasco, SAF2006 / 00918, στον M. Guzmán και στο BFU2006-00508, στον P. Boya), Santander-Complutense PR34 / 07-15856, προς τον G. Velasco), Comunidad de Madrid (S-SAL / 0261/2006, προς τον M. Guzmán) και La Ligue contre le Cancer and Canceropole PACA (στην JL Iovanna). Ο M. Salazar ήταν ο αποδέκτης μιας υποτροφίας από το MEC. Ο A. Carracedo ήταν ο αποδέκτης υποτροφιών από το Gobierno Vasco, την Ομοσπονδία Ευρωπαϊκών Βιοχημικών Εταιρειών και τον Ευρωπαϊκό Οργανισμό Μοριακής Βιολογίας. Οι M. Lorente και P. Boya έχουν συμβόλαιο Juan de la Cierva και Ramón y Cajal από το MEC, αντίστοιχα. ΜΙΚΡΟ.Η Hernández-Tiedra έχει σύμβαση τεχνικού από το ισπανικό Υπουργείο Παιδείας και το Fondo Social Europeo. Οι συγγραφείς ευχαριστούν τον Dario Alessi (Πανεπιστήμιο του Dundee, Dundee, Ηνωμένο Βασίλειο) για τη δωρεά αντισωμάτων αντι-PRAS40 και για την τεχνική υποστήριξη για πειράματα ανοσοκαθίζησης. Gemma Fabriàs, Josefina Casas και Eva Dalmau (Instituto de Investigaciones Químicas y Ambientales, Barcelona, Spain) για την ανάλυση δειγμάτων κεραμιδίου. Οι José Lizcano, José Bayascas, María M. Caffarel και Patrizia Agostinis για τις πειραματικές τους προτάσεις. και άλλα μέλη του εργαστηρίου μας για τη συνεχή υποστήριξή τους.Ηνωμένο Βασίλειο) για τη δωρεά αντισωμάτων αντι-PRAS40 και για τεχνική υποστήριξη για πειράματα ανοσοκαθίζησης · Gemma Fabriàs, Josefina Casas και Eva Dalmau (Instituto de Investigaciones Químicas y Ambientales, Barcelona, Spain) για την ανάλυση δειγμάτων κεραμιδίου. Οι José Lizcano, José Bayascas, María M. Caffarel και Patrizia Agostinis για τις πειραματικές τους προτάσεις. και άλλα μέλη του εργαστηρίου μας για τη συνεχή υποστήριξή τους.Ηνωμένο Βασίλειο) για τη δωρεά αντισωμάτων αντι-PRAS40 και για τεχνική υποστήριξη για πειράματα ανοσοκαθίζησης · Gemma Fabriàs, Josefina Casas και Eva Dalmau (Instituto de Investigaciones Químicas y Ambientales, Barcelona, Spain) για την ανάλυση δειγμάτων κεραμιδίου. Οι José Lizcano, José Bayascas, María M. Caffarel και Patrizia Agostinis για τις πειραματικές τους προτάσεις. και άλλα μέλη του εργαστηρίου μας για τη συνεχή υποστήριξή τους.Caffarel και Patrizia Agostinis για τις πειραματικές τους προτάσεις. και άλλα μέλη του εργαστηρίου μας για τη συνεχή υποστήριξή τους.Caffarel και Patrizia Agostinis για τις πειραματικές τους προτάσεις. και άλλα μέλη του εργαστηρίου μας για τη συνεχή υποστήριξή τους.
Υποσημειώσεις
Σύγκρουση συμφερόντων: Οι συγγραφείς δήλωσαν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.
Χρησιμοποιούνται μη τυπικές συντομογραφίες: Atg, αυτοφαγική πρωτεΐνη; eIF2α, ευκαρυωτικός παράγοντας έναρξης μετάφρασης 2α; MEF, εμβρυϊκός ινοβλάστης ποντικού. THC, Δ 9 -τετραϋδροκανναβινόλη; mTORC1, στόχος θηλαστικών του συμπλέγματος ραπαμυκίνης 1; PDI, πρωτεΐνη δισουλφιδική ισομεράση; TRB3, tribbles homolog 3.
Παραπομπή για αυτό το άρθρο: J. Clin. Επενδύω. 119 : 1359–1372 (2009). doi: 10.1172 / JCI37948
Η παρούσα διεύθυνση του Arkaitz Carracedo και της Ainara Egia είναι: Πρόγραμμα Γενετικής Καρκίνου, Κέντρο Καρκίνου και Ιατρικής Καρκίνου Beth Israel Deaconess, Ιατρικό Κέντρο Beth Israel Deaconess, Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ, Βοστώνη, Μασαχουσέτη, ΗΠΑ.
βιβλιογραφικές αναφορές
Τα άρθρα από την Εφημερίδα της Κλινικής Έρευνας παρέχονται εδώ ευγενική προσφορά της Αμερικανικής Εταιρείας Κλινικής Έρευνας
Εθνικό Κέντρο Βιοτεχνολογίας , Εθνική Βιβλιοθήκη Ιατρικής των ΗΠΑ 8600 Rockville Pike , Bethesda MD , 20894 ΗΠΑ
Αφήστε μια απάντηση